經(jīng)方“大黃附子湯”及其有效成分保護(hù)腎小管損傷分子機(jī)制的研究.pdf

1、背景及目的：
　　目前，在世界范圍內(nèi)，慢性腎臟病(CKD)已經(jīng)成為危害公眾健康的重大公共衛(wèi)生問題。研究表明，腎小管損傷是CKD進(jìn)展至終末期腎病的主要病理特征之一。腎小管損傷主要是指腎小管上皮細(xì)胞死亡，其形式包括“壞死、凋亡和自噬”，其中，“細(xì)胞凋亡”和“細(xì)胞自噬”是影響腎小管上皮細(xì)胞死亡的重要調(diào)控機(jī)制;細(xì)胞凋亡與TGF-β1/JNK信號(hào)通路密切相關(guān)，細(xì)胞自噬與AMPK/mTOR/p70S6K和MAPKs信號(hào)通路密切相關(guān)。經(jīng)方“大黃

2、附子湯(DFD)”（《金匱要略》）作為“溫陽泄?jié)岱ā钡拇硇灾兴帍?fù)方，在臨床上廣泛運(yùn)用于治療各類CKD，而且，有一定的療效。國(guó)內(nèi)外的既往研究表明，DFD及其有效成分大黃酸在體內(nèi)外具有抗凋亡或抗纖維化的作用，然而，相關(guān)的分子藥理機(jī)制不甚清楚。因此，筆者提出假說:經(jīng)方“大黃附子湯”及其有效成分“大黃酸”可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡或細(xì)胞自噬而保護(hù)腎小管損傷。基于此，首先，筆者闡明DFD在體內(nèi)減輕細(xì)胞凋亡保護(hù)腎小管損傷的作用和機(jī)制;其次，揭示DFD和

3、大黃（DFD的“君藥”）在體內(nèi)干預(yù)自噬改善腎小管損傷的作用和機(jī)制;最后，研究DFD有效成分——“大黃酸”在體外干預(yù)自噬調(diào)節(jié)腎小管損傷的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.在第一組實(shí)驗(yàn)中，筆者將27只SD大鼠隨機(jī)分成正常組(A)、模型組(B)、大黃附子湯組(C)、別嘌呤醇組(D)。在實(shí)驗(yàn)開始后的第1-14天期間，經(jīng)灌胃給予B、C、D組大鼠腺嘌呤混懸液(150 mg/kg·d)而建立腎小管損傷（腎衰竭）動(dòng)物模型;在第15-35天期間

4、，分別用大黃附子湯(2.5 g/kg·d)和別嘌呤醇(0.03 g/kg·d)給C、D組大鼠灌胃;同時(shí)，用蒸餾水給A、B組大鼠灌胃。在給藥的過程中，每隔3天，連續(xù)用腺嘌呤混懸液(150 mg/kg·d)給B、C、D組大鼠灌胃，以維持模型鼠腎功能在一定的損傷水平。在實(shí)驗(yàn)過程中，每周稱大鼠體重，在造模前后和藥物干預(yù)后第3周末（實(shí)驗(yàn)開始后的第35天），分別檢測(cè)血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、血清尿酸(SUA)以及24h尿蛋白排泄量(

5、Upro)、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(UNAG)。在藥物干預(yù)后第3周末，處死全部大鼠，留取血液標(biāo)本，摘取雙腎，稱重，留取腎臟標(biāo)本，觀察腎臟外觀、腎小管/間質(zhì)形態(tài)特征和腎小管上皮細(xì)胞凋亡特征（包括TUNEL染色以及腎組織Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平等）等;檢測(cè)血清和尿液生化指標(biāo)、腎組織TGF-β1/JNK信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子TGF-β1、JNK和p-JNK蛋白表達(dá)水平。該組實(shí)驗(yàn)試圖闡明大黃附

6、子湯在體內(nèi)減輕細(xì)胞凋亡保護(hù)腎小管損傷的作用和機(jī)制。
　　2.在第二組實(shí)驗(yàn)中，筆者將33只SD大鼠隨機(jī)分成正常組(A)、模型組(B)、大黃附子湯組(C)、大黃組(D)和纈沙坦組(E)。在實(shí)驗(yàn)開始后的第1-14天期間，經(jīng)灌胃給予B、C、D、E組大鼠腺嘌呤混懸液(150 mg/kg· d)而建立腎小管損傷（腎衰竭）動(dòng)物模型;在第15-35天期間，分別用大黃附子湯(2.5 g/kg· d)、大黃溶液(1 g/kg·d)和纈沙坦溶液(8 m

7、g/kg·d)給C、D、E組大鼠灌胃;同時(shí)，用蒸餾水給A、B組大鼠灌胃。在給藥的過程中，每隔3天，連續(xù)用腺嘌呤混懸液(150 mg/kg·d)給B、C、D、E組大鼠灌胃，以維持模型鼠腎功能在一定的損傷水平。在藥物干預(yù)后的第3周末，處死全部大鼠，采集腎組織，進(jìn)行自噬指標(biāo)——LC3以及腎臟纖維化指標(biāo)——CollagenⅠ和Fibronectin的免疫組化染色及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)。該組實(shí)驗(yàn)試圖揭示大黃附子湯和大黃在體內(nèi)干預(yù)自噬改善腎小管損傷的作

8、用和機(jī)制。
　　3.在第三組實(shí)驗(yàn)中，筆者用Hank's平衡鹽溶液(HBSS)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)細(xì)胞產(chǎn)生饑餓狀態(tài)，發(fā)生自噬，同時(shí)，聯(lián)合或不聯(lián)合大黃酸，檢測(cè)LC3Ⅰ/Ⅱ的蛋白表達(dá)水平，Akt/AMPK/mTOR/p70S6K信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子p-Akt Ser473、Akt、p-AMPK、AMPK、mTOR、p-mTOR Ser2448、p-p70S6K的蛋白表達(dá)水平以及MAPKs信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子p-p38、p

9、-Erk和p-JNK的蛋白表達(dá)水平。用HBSS和巴佛洛霉素A1（Bafilomycin A1，自噬抑制劑）聯(lián)合或不聯(lián)合大黃酸干預(yù)NRK-52E細(xì)胞，用HBSS和大黃酸聯(lián)合或不聯(lián)合雷帕霉素（Rapamycin，mTOR抑制劑）干預(yù)NRK-52E細(xì)胞，用HBSS聯(lián)合或不聯(lián)合大黃酸干預(yù)轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染Deptor質(zhì)粒（mTOR抑制劑）的NRK-52E細(xì)胞，以及用HBSS聯(lián)合或不聯(lián)合SB203580（p38抑制劑）或PD098059（Erk抑制劑）

10、干預(yù)NRK-52E細(xì)胞，檢測(cè)LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達(dá);用HBSS和大黃酸聯(lián)合或不聯(lián)合二甲雙胍（Metformin，AMPK激動(dòng)劑）干預(yù)NRK-52E細(xì)胞，檢測(cè)LC3Ⅰ/Ⅱ、p-AMPK、AMPK和p-p70S6K蛋白表達(dá)。用HBSS和Bafilomycin A1聯(lián)合或不聯(lián)合大黃酸、SB203580或PD098059，用HBSS、Bafilomycin A1和大黃酸聯(lián)合或不聯(lián)合Metformin，干預(yù)轉(zhuǎn)染了mRFP-LC3質(zhì)粒的NRK-52E

11、和Hela細(xì)胞，觀察mRFP-LC3熒光顆粒情況。該組實(shí)驗(yàn)試圖研究DFD有效成分——“大黃酸”在體外干預(yù)自噬調(diào)節(jié)腎小管損傷的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)灌胃給予腺嘌呤14天后，模型鼠Upro、UNAG、BUN、Scr、SUA明顯升高，出現(xiàn)腎小管/間質(zhì)病變和腎小管上皮細(xì)胞凋亡。在藥物干預(yù)3周后，DFD、別嘌呤醇能改善模型鼠腎功能、Upro和UNAG，減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡，緩解腎間質(zhì)纖維化程度，下調(diào)腎組織Bax和Clea

12、ved caspase-3蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，并且，抑制TGF-β1和p-JNK蛋白表達(dá)。大黃附子湯組的各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于別嘌呤醇組。
　　2.經(jīng)灌胃給予腺嘌呤14天后，模型組大鼠腎組織內(nèi)腎小管擴(kuò)張明顯，腎小管上皮細(xì)胞脫落，腎間質(zhì)面積增加，模型鼠腎組織LC3、CollagenⅠ和Fibronectin免疫組化染色及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。在DFD、大黃和纈沙坦干預(yù)3周后，腎小管擴(kuò)張、腎小管上皮細(xì)胞脫落和間質(zhì)面積增加稍有改善，模型

13、鼠LC3、CollagenⅠ和Fibronectin免疫組化染色和蛋白表達(dá)明顯減輕。DFD、大黃和纈沙坦三組之間各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.(1)大黃酸抑制HBSS誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制HBSS和Bafilomycin A1誘導(dǎo)的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化和mRFP-LC3熒光顆粒，說明大黃酸可以抑制HBSS誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞自噬;(2)大黃酸增加HBSS抑制的p-mTOR Ser244

14、8和p-p70S6K蛋白表達(dá)，Rapamycin逆轉(zhuǎn)HBSS和大黃酸共同干預(yù)抑制的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，大黃酸不能抑制HBSS誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染了Deptor質(zhì)粒的NRK-52E細(xì)胞LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，說明大黃酸抑制HBSS誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞自噬，可能是通過激活mTOR/p70S6K信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的;(3)大黃酸抑制HBSS誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞p-AMPK蛋白表達(dá)，而對(duì)p-Akt Ser473蛋白表達(dá)沒有明顯影響，Metformin能

15、逆轉(zhuǎn)HBSS和大黃酸聯(lián)合干預(yù)NRK-52E細(xì)胞抑制的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化、p-AMPK蛋白表達(dá)和促進(jìn)的p-p70S6K蛋白表達(dá)，Metformin還能促進(jìn)大黃酸抑制HBSS和Bafilomycin A1聯(lián)合干預(yù)誘導(dǎo)的mRFP-LC3熒光顆粒，說明大黃酸抑制HBSS誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞自噬，不是通過Akt信號(hào)通路，而是通過AMPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的;(4)大黃酸抑制HBSS誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞p-p38和p-Erk蛋白表達(dá)，而對(duì)p-J

16、NK蛋白表達(dá)無明顯影響，SB203580和PD098059均能抑制HBSS誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，以及HBSS和BafilomycinA1聯(lián)合干預(yù)誘導(dǎo)的mRFP-LC3熒光顆粒，說明大黃酸抑制HBSS誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞自噬，可能是通過抑制p38和Erk MAPKs信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，大黃酸可能具有類似于p38和Erk抑制劑的作用。
　　結(jié)論:
　　1.DFD在體內(nèi)可能是通過下調(diào)腺嘌呤誘導(dǎo)腎小管損傷模

17、型鼠腎組織中TGF-β1和p-JNK蛋白表達(dá)，干擾TGF-β1/JNK通路中相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而減輕模型鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡和緩解腎間質(zhì)纖維化。因此，TGF-β1/JNK通路既是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要途徑，也是DFD保護(hù)模型鼠腎小管損傷的作用靶點(diǎn)。
　　2.DFD和大黃在體內(nèi)不僅可以改善腺嘌呤誘導(dǎo)腎小管損傷模型鼠腎小管擴(kuò)張、腎小管上皮細(xì)胞脫落和間質(zhì)面積增加，而且還能減少腎臟LC3、CollagenⅠ和Fibronectin蛋白表達(dá)。因此