同型半胱氨酸與銅聯(lián)合作用誘導心肌細胞損傷的機制研究.pdf

1、目的：
　　大量研究表明高同型半胱氨酸血癥（HHcy）和高銅血癥是心血管疾病的兩個相對獨立的危險因子，當兩者同時存在時可大大增強對心血管系統(tǒng)的損傷作用，同型半胱氨酸與銅的比例不同時對心血管系統(tǒng)的損傷也不相同，本研究探討Hcy和Cu的聯(lián)合作用對乳鼠心肌細胞的損傷及不同比例的Hcy、Cu同時存在時對心肌細胞的損傷作用，探討細胞死亡的方式及加入抗氧化劑后能否起到保護作用。
　　方法：
　　1、提取原代心肌細胞后分成若干實驗組

2、，MTT實驗組分為Hcy50、100、200μM，Cu50、100、200μM，Hcy/Cu比例為4/1、2/1，1/1組處理72h，DCF-DA、Mitosox-Red及羅丹明123染色劑組分為Hcy100μM+Cu50μM處理2、4、8、16、24h，Hcy50、100、200μM，Cu50、100、200μM，及Hcy100μM、Hcy100μM+Cu25μM、Hcy100μM+Cu50μM、Hcy100μM+Cu100μM組處理

3、24h，NOX實驗分為對照組、Hcy100μM+Cu50μM組處理24h，氧消耗率實驗分為對照組及Hcy100μM+Cu50μM組處理8h，qRT-PCR實驗分為Hcy100μM+Cu50μM2、4、8、12、24h組，westernblot實驗分為對照組，H200μM+Cu100μM8h、12h、24h、48h,H200μM+Cu50μM12h、24h、48h、72h，H100μM+Cu50μM24h、48h、72h，對照組，H100

4、μM+Cu50μM24h，H100μM+Cu50μM+NH4CL2024h，H100μM+Cu50μM+3MA24h等組。
　　2、MTT實驗檢測細胞的存活率；DCF-DA染色劑檢測細胞內(nèi)ROS的含量；Mitosox-Red染色劑檢測線粒體內(nèi)ROS的含量；羅丹明123檢測細胞膜電位的變化；化學發(fā)光法檢測檢測NADPH氧化酶（NOX）的活性；細胞能量代謝實時測定儀檢測氧消耗率。TUNAL、DAPI染色檢測心肌細胞的死亡方式；qRT-

5、PCR法檢測p53、SCO2mRNA水平，westernblot檢測心肌細胞LC3蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1、在倒置顯微鏡觀察下，體外培養(yǎng)的原代心肌細胞形態(tài)隨著時間的增加發(fā)生變化，培養(yǎng)24小時后部分心肌細胞開始搏動，72小時后大部分細胞同步搏動，且頻率在60-100次/分，經(jīng)Hcy和Cu處理后細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。細胞開始變圓，胞內(nèi)出現(xiàn)空泡現(xiàn)象。
　　2、處理72h后，MTT結(jié)果提示Hcy和Cu單獨處理對心肌細胞

6、的損傷作用并不明顯，當Hcy與Cu聯(lián)合處理后極大的引起心肌細胞死亡，且隨著Cu/Hcy比例的上升，損傷作用更明顯。
　　3、DCF-DA染色實驗：無論是Hcy、Cu單獨處理還是Hcy與Cu聯(lián)合處理細胞內(nèi)的ROS無明顯變化。
　　4、Mitosox-Red染色實驗：Hcy、Cu單獨處理后線粒體的ROS變化并不明顯，但兩者共同作用后線粒體內(nèi)ROS增加，且在一定時間內(nèi)隨著Cu/Hcy的比值的升高ROS產(chǎn)生增多。
　　5、HE

7、T染色實驗：Hcy與Cu共同作用后細胞質(zhì)內(nèi)超氧陰離子增加。
　　6、羅丹明123染色實驗：隨著Hcy溶度的升高，細胞的存活率下降，Hcy與Cu共同作用后細胞的存活率顯著下降，且隨著處理時間的延長及Cu/Hcy的比例的上升細胞存活率下降。
　　7、NADPH氧化酶（NOX）活性：經(jīng)Hcy和Cu聯(lián)合處理后，NOX活性并不增加。
　　8、心肌細胞氧消耗率：經(jīng)過Hcy和Cu聯(lián)合處理后，線粒體復合物活性下降。
　　9、TU

8、NEL、DAPI染色實驗：TUNEL染色為陰性，兩組DAPI染色圖無明顯區(qū)別，兩者的合并圖也無明顯區(qū)別。
　　10、qRT-PCR實驗結(jié)果，經(jīng)Hcy和Cu聯(lián)合處理后，細胞p53、SCO2mRNA的量迅速減少。
　　11、各組心肌細胞LC3蛋白表達：Hcy+Cu處理后隨著時間的增加LC3Ⅱ的表達量逐漸增加。Hcy+Cu的溶度升高后LC3Ⅱ的表達量亦增加，加入3-MA后LC3Ⅱ表達量下降，而加入氯化銨后LC3Ⅱ表達量繼續(xù)增加。<