小檗堿對(duì)同型半胱氨酸損傷內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中，內(nèi)皮細(xì)胞功能不全是重要的發(fā)病機(jī)制和表現(xiàn)，其中內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)下降，引起內(nèi)皮介導(dǎo)的血管舒張功能、抑制血管平滑肌增殖和遷移等功能受損，是心血管疾病中內(nèi)皮功能不全的研究熱點(diǎn)。高同型半胱氨酸血癥是心血管危險(xiǎn)因素之一，同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)可影響非對(duì)稱性二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）代謝的相

2、關(guān)酶，導(dǎo)致ADMA累積，而ADMA可競(jìng)爭(zhēng)性抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的活性，降低內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)量，損傷內(nèi)皮功能。小檗堿(berberine，BBR)是從中草藥黃連等植物中提取分離得到的一類異喹啉類生物堿。細(xì)胞及動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿具有保護(hù)內(nèi)皮的功能，可減少氧化應(yīng)激、增加NO的表達(dá)、減少凋亡等，臨床研究也發(fā)現(xiàn)，小檗堿在控制血壓、血糖、抗心室重構(gòu)等方面有良好作用。但目前尚無研究探究小檗堿在同型半管

3、氨酸損傷條件下對(duì)內(nèi)皮功能的保護(hù)作用，以及此保護(hù)作用是否與ADMA代謝通路相關(guān)。本研究在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)體系中，探究小檗堿對(duì)同型半胱氨酸損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為小檗堿的內(nèi)皮保護(hù)機(jī)制提供新的思路。
　　方法:
　　在體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞同步化后，在培養(yǎng)體系中加入300μM或500μM濃度的同型半胱氨酸，培養(yǎng)12h、24h、48h后

4、收集細(xì)胞和上清，并提取細(xì)胞中總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用CCK8試劑盒細(xì)胞活性，用Griess法測(cè)定細(xì)胞上清液中NO濃度，用LC-MS法測(cè)定細(xì)胞上清液中ADMA濃度，并用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative polymerase chain reacti on，qPCR)法測(cè)定NO及ADMA代謝相關(guān)酶mRNA表達(dá)水平的變化，以探究Hcy損傷內(nèi)皮細(xì)胞的表現(xiàn)和機(jī)制。之后，在上述加入Hcy的損傷體系中，加用0、1.25μM、2

5、.5μM、5.0μM、10.0μM濃度的小檗堿干預(yù)，培養(yǎng)12h、24h、48h后，用同樣的方法收集細(xì)胞和上清，并測(cè)定上述指標(biāo)的變化情況，以探究小檗堿對(duì)Hcy損傷條件下的內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　結(jié)果:
　　同型半胱氨酸在300μM濃度下對(duì)HUVEC細(xì)胞活性無顯著影響，但500μM濃度則可引起細(xì)胞活性顯著降低。同型半胱氨酸可降低eNOS和DDAH1表達(dá)、增加PRMT表達(dá)，導(dǎo)致ADMA累積，損傷內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO的能力。在同型半胱

6、氨酸損傷條件下，小檗堿干預(yù)可提高HUVEC細(xì)胞活性，降低ADMA水平，增加HUVEC的NO產(chǎn)量，但在大劑量同型半胱氨酸損傷、小檗堿干預(yù)時(shí)間較長(zhǎng)以后，可導(dǎo)致NO水平進(jìn)一步降低。在某些條件下，小檗堿可增加eNOS和DDAH1的表達(dá)，降低PRMT1表達(dá)，發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　同型半胱氨酸對(duì)HUVEC細(xì)胞活性和NO產(chǎn)生有損傷作用，可能與降低eNOS和DDAH1表達(dá)、增加PRMT1表達(dá)，從而引起ADMA累積有關(guān)，但具體機(jī)