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文檔簡介
1、目的:
采用6MV X線照射人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)以及RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi)沉默內(nèi)皮細胞的乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene1, BRCA1)后,觀察對細胞BRCA1和p21基因表達,細胞周期停滯及細胞凋亡的影響,探討“BRCA1-p21-細胞周期”軸在放
2、射性心臟損傷發(fā)揮保護作用的可能性。
方法:
1.通過免疫蛋白印跡(Western blot)檢測HUVEC在總照射劑量為20Gy的X線照射0、2、4、6、8、10、24、48h后,BRCA1和p21蛋白表達量改變。再檢測HUVEC在劑量梯度為0、2、4、6、8、10、12、20Gy的X線照射后4h, BRCA1和p21蛋白表達量改變。
2.流式細胞儀檢測HUVEC在總照射劑量為20Gy的X線照射0、2、4、
3、6、8、10、24、48h后細胞周期分布。再檢測HUVEC在劑量梯度為0、2、4、6、8、10Gy的X線照射后24h細胞周期分布。
3.設(shè)計并化學合成針對BRCA1的3對小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA),采用陽離子脂質(zhì)體法進行瞬時轉(zhuǎn)染。設(shè)正常組、siRNA對照組以及siRNA-BRCA1-4341、siRNA-BRCA1-951、siRNA-BRCA1-410轉(zhuǎn)染組。
4.通過
4、Western blot檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞中BRCA1蛋白表達水平,選擇沉默有效的siRNA序列用于后續(xù)實驗。
5.通過Western blot檢測正常組、siRNA對照組及有效沉默組細胞在下調(diào)BRCA1后,p21蛋白表達量改變。
6.運用流式細胞儀檢測細胞轉(zhuǎn)染前后細胞周期分布和細胞凋亡變化。
結(jié)果:
1. Western blot顯示HUVEC中BRCA1及p21蛋白的表達隨照射后時間的延長而逐
5、漸增加,而且p21在放射線照射后4小時異常表達升高;HUVEC細胞照射4h后,BRCA1及p21蛋白的表達隨照射劑量的增加而逐漸增加。
2.流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,HUVEC細胞周期阻滯隨照射時間的增加而逐漸明顯,在照射后24h開始出現(xiàn)明顯的G2期阻滯;HUVEC照射后細胞G2期阻滯隨照射劑量的增加逐漸明顯。
3.3個特異性BRCA1-siRNAs轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染48h后,BRCA1的蛋白表達水平與正常組及陰性對照組比
6、較出現(xiàn)下降,三個片段均顯示可以有效沉默BRCA1蛋白的表達,而且siRNA-BRCA1-951、siRNA-BRCA1-410轉(zhuǎn)染組明顯抑制BRCA1表達并顯著下調(diào)p21蛋白的表達。
4.流式細胞儀檢測顯示,BRCA1-siRNAs轉(zhuǎn)染組HUVEC的細胞周期G2期阻滯減少,凋亡率增高。
結(jié)論:
1. HUVEC在X線照射后BRCA1和p21蛋白表達明顯增加,細胞被阻滯于G2期。
2. HUVEC在
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