X線及基因沉默對人血管內(nèi)皮細(xì)胞BRCA1、p21表達(dá)和細(xì)胞周期的影響.pdf

1、目的：
　　采用6MV X線照射人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell， HUVEC）以及RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)沉默內(nèi)皮細(xì)胞的乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene1, BRCA1）后，觀察對細(xì)胞BRCA1和p21基因表達(dá)，細(xì)胞周期停滯及細(xì)胞凋亡的影響,探討“BRCA1-p21-細(xì)胞周期”軸在放

2、射性心臟損傷發(fā)揮保護(hù)作用的可能性。
　　方法：
　　1.通過免疫蛋白印跡（Western blot）檢測HUVEC在總照射劑量為20Gy的X線照射0、2、4、6、8、10、24、48h后，BRCA1和p21蛋白表達(dá)量改變。再檢測HUVEC在劑量梯度為0、2、4、6、8、10、12、20Gy的X線照射后4h， BRCA1和p21蛋白表達(dá)量改變。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測HUVEC在總照射劑量為20Gy的X線照射0、2、4、

3、6、8、10、24、48h后細(xì)胞周期分布。再檢測HUVEC在劑量梯度為0、2、4、6、8、10Gy的X線照射后24h細(xì)胞周期分布。
　　3.設(shè)計(jì)并化學(xué)合成針對BRCA1的3對小干擾RNA(small interfering RNA， siRNA)，采用陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。設(shè)正常組、siRNA對照組以及siRNA-BRCA1-4341、siRNA-BRCA1-951、siRNA-BRCA1-410轉(zhuǎn)染組。
　　4.通過

4、Western blot檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中BRCA1蛋白表達(dá)水平，選擇沉默有效的siRNA序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　5.通過Western blot檢測正常組、siRNA對照組及有效沉默組細(xì)胞在下調(diào)BRCA1后，p21蛋白表達(dá)量改變。
　　6.運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡變化。
　　結(jié)果：
　　1. Western blot顯示HUVEC中BRCA1及p21蛋白的表達(dá)隨照射后時間的延長而逐

5、漸增加，而且p21在放射線照射后4小時異常表達(dá)升高；HUVEC細(xì)胞照射4h后，BRCA1及p21蛋白的表達(dá)隨照射劑量的增加而逐漸增加。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，HUVEC細(xì)胞周期阻滯隨照射時間的增加而逐漸明顯，在照射后24h開始出現(xiàn)明顯的G2期阻滯；HUVEC照射后細(xì)胞G2期阻滯隨照射劑量的增加逐漸明顯。
　　3.3個特異性BRCA1-siRNAs轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染48h后，BRCA1的蛋白表達(dá)水平與正常組及陰性對照組比

6、較出現(xiàn)下降，三個片段均顯示可以有效沉默BRCA1蛋白的表達(dá)，而且siRNA-BRCA1-951、siRNA-BRCA1-410轉(zhuǎn)染組明顯抑制BRCA1表達(dá)并顯著下調(diào)p21蛋白的表達(dá)。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測顯示，BRCA1-siRNAs轉(zhuǎn)染組HUVEC的細(xì)胞周期G2期阻滯減少，凋亡率增高。
　　結(jié)論：
　　1. HUVEC在X線照射后BRCA1和p21蛋白表達(dá)明顯增加，細(xì)胞被阻滯于G2期。
　　2. HUVEC在