不同糖環(huán)境對(duì)FGL2基因沉默后的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞全基因表達(dá)譜的影響.pdf

1、目的：心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Myocardial microvascular endothelial cells，MMVECs)是微血管的基本結(jié)構(gòu)，也是心臟重要的內(nèi)分泌器官。許多心血管系統(tǒng)疾病的致病因子以心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為靶器官;而心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能障礙又是許多心血管疾病的起病原因。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DC)是糖尿病的常見(jiàn)慢性并發(fā)癥，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，高糖導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能

2、紊亂的機(jī)制尚不完全清楚。有研究表明，高血糖對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可能是DC時(shí)心肌細(xì)胞損傷的促發(fā)因素。纖維蛋白原樣蛋白2(Fibrinogen-like protein2，F(xiàn)gl2)凝血酶原酶又稱纖維介素，是近年來(lái)熱點(diǎn)研究的凝血因子，涉及多種疾病的病理生理過(guò)程。本研究旨在通過(guò)高通量表達(dá)譜芯片技術(shù)，觀察不同葡萄糖濃度培養(yǎng)對(duì)Fgl2基因沉默的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞全基因表達(dá)譜的影響，從分子水平探討糖環(huán)境和Fgl2基因?qū)ξ⒀軆?nèi)皮細(xì)胞功能影響可

3、能的基因和分子機(jī)制，為糖尿病心肌微血管病變的治療提供新的靶點(diǎn)和思路。
　　方法：⑴原代大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取、培養(yǎng)和鑒定:取一周齡健康清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠，無(wú)菌條件下取出心臟，酶消化法培養(yǎng)原代MMVECs。待原代細(xì)胞單層融合后消化傳代，取第二代細(xì)胞經(jīng)免疫熒光法鑒定MMVECs特征性表面抗原CD31-RA和F(VIII)-RA。⑵按基因沉默設(shè)計(jì)原則構(gòu)建fgl2shRNA慢病毒表達(dá)載體和空載陰性對(duì)照，并

4、轉(zhuǎn)染MMVECs，免疫熒光鑒定是否轉(zhuǎn)染成功。⑶通過(guò)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)查詢RGSC3.4版大鼠表達(dá)譜基因信息，應(yīng)用無(wú)膜芯片合成技術(shù)合成大鼠12×135K Array表達(dá)譜芯片，每個(gè)芯片含有26419個(gè)基因。單個(gè)基因在每張芯片上設(shè)計(jì)了3個(gè)以上的探針，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。⑷實(shí)驗(yàn)分組:取培養(yǎng)的第三代MMVECs，分為高糖培養(yǎng)和正糖培養(yǎng)兩大組。各包含三個(gè)亞組：?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)組（空白對(duì)照組）；空載體轉(zhuǎn)染組(GFP組)；fgl2RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染組（fgl

5、2shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染組）。⑸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，提取RNA，檢測(cè)RNA質(zhì)量;cDNA合成和標(biāo)記;將標(biāo)記好的探針和表達(dá)譜芯片雜交;圖像采集和數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：①分離培養(yǎng)原代大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞成功，純度達(dá)95％以上，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)出典型的“鋪路石樣”形態(tài)。②經(jīng)免疫熒光法檢測(cè)，細(xì)胞CD31、F(VIII)陽(yáng)性率達(dá)90％以上。CD31主要呈紅色熒光分布在細(xì)胞膜中;F(VIII)主要呈綠色熒光分布在胞漿中。③經(jīng)酶切及DNA測(cè)序檢測(cè)f

6、gl2shRNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。經(jīng)fgl2shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染36h后，90％以上的MMVECs可觀察到綠色熒光蛋白顯影，證明病毒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)。④表達(dá)譜芯片結(jié)果表明，高糖組和正糖組組內(nèi)對(duì)比全基因表達(dá)譜有明顯差異，病毒轉(zhuǎn)染組在高糖、正糖組間也有明顯差異。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組對(duì)比，篩選出部分單純Fgl2基因沉默和單純糖環(huán)境引起的表達(dá)顯著差異基因。結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：成功培養(yǎng)大鼠原代心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞

7、;fgl2shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功;成功用fgl2shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染MMVECs;高糖組、正糖組各組內(nèi)MMVECs全基因表達(dá)譜有明顯差異，證明Fgl2基因通過(guò)RNA干擾影響多個(gè)MMVECs基因的表達(dá);fgl2shRNA慢病毒轉(zhuǎn)然后在不同糖環(huán)境下培養(yǎng)，MMVECs全基因表達(dá)譜有明顯差異，證明不同糖環(huán)境下生長(zhǎng)的細(xì)胞其基因表達(dá)譜是有改變的。Fgl2基因通過(guò)RNA干擾對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的Smoc1、Scn7a、Epyc、Mal2、H