登革病毒感染對(duì)人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響.pdf

1、登革病毒(Dengue virus，DEN)作為世界上最重要的人類(lèi)蟲(chóng)媒病毒之一已經(jīng)威脅到熱帶和亞熱帶超過(guò)100個(gè)國(guó)家的25億人口。登革病毒一般情況下導(dǎo)致登革熱(dengue fever，DF)，但是部分病人可以進(jìn)展為登革出血熱(denguehemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome，DSS)。DHF和DSS的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，一般認(rèn)為主要是由于病毒和宿主相互作用而介導(dǎo)。DHF

2、/DSS為重癥的登革病毒感染，其主要的特征之一是血漿滲漏。DF進(jìn)展到DHF/DSS的過(guò)程尚未闡明，目前普遍認(rèn)為DHF/DSS發(fā)病機(jī)制包括登革血清型間的交叉免疫反應(yīng)、病毒的毒力以及感染后產(chǎn)生的抗體依賴(lài)增強(qiáng)(ADE)效應(yīng)在DHF/DSS的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。一些免疫效應(yīng)分子參與其病理機(jī)制。細(xì)胞因子水平尤其是腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)和一些化學(xué)介質(zhì)的快速升高在DHF/DSS發(fā)病中起到了重要的作用，

3、引起一系列相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，如血漿外滲、休克、出血等。[2]而作為DHF/DSS發(fā)病中最重要的靶點(diǎn)——血管內(nèi)皮細(xì)胞在登革病毒感染后又出現(xiàn)怎樣的變化呢?為了更好地揭示這個(gè)問(wèn)題，本課題組用Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0芯片研究登革病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞后基因表達(dá)譜的變化。
　　 基因芯片技術(shù)是伴隨著人類(lèi)基因組工程而興起的一門(mén)嶄新的技術(shù)，是一項(xiàng)專(zhuān)業(yè)基因分析技術(shù)，主要包括分析基因序列、檢測(cè)基因突變和

4、診斷疾病基因?；蛐酒夹g(shù)能夠檢測(cè)成千上萬(wàn)基因的表達(dá)水平。通過(guò)分析這些數(shù)據(jù)，我們能夠全面了解登革病毒感染中各種基因表達(dá)的變化及其相應(yīng)功能，為進(jìn)一步研究這些基因與疾病之間的關(guān)系提供依據(jù)。[3]通過(guò)全面分析基因芯片結(jié)果，我們對(duì)登革病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞前后的基因表達(dá)變化有了全面和較為深刻的認(rèn)識(shí)。
　　 目的：
　　 本研究旨在全面了解血管內(nèi)皮細(xì)胞在登革病毒感染后基因水平的變化。
　　 內(nèi)容和方法：
　　 1.原

5、代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的分離、培養(yǎng)、鑒定：
　　 取新鮮臍帶分離、培養(yǎng)原代HUVEC。采用Ⅷ因子抗原免疫組織化學(xué)技術(shù)鑒定所分離的細(xì)胞。用生長(zhǎng)穩(wěn)定，形態(tài)良好的第二至第四代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 2.芯片實(shí)驗(yàn)：
　　 通過(guò)總核糖核酸(RiboNucleic Acid，RNA)的提取和純化，互補(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementa

6、ry Deoxyribonucleic acid，cDNA)的合成和純化，體外轉(zhuǎn)錄(In Vitro Transcription，IVT)合成互補(bǔ)核糖核酸(Complementary RiboNucleicacid，cRNA)和cRNA的純化，cRNA片段化、配制雜交液，芯片雜交，洗脫芯片，掃描芯片過(guò)程來(lái)完成芯片制作。
　　 3.基因芯片數(shù)據(jù)分析：
　　 采用專(zhuān)業(yè)芯片分析軟件和相關(guān)網(wǎng)站對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　 4.

7、實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)：
　　 通過(guò)設(shè)計(jì)引物，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，熒光定量PCR等步驟來(lái)完成實(shí)時(shí)定量PCR的實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.本研究共分離3個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本均分為感染與未感染兩個(gè)組，共6張芯片。采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析感染組與未感染組間差異篩選出干擾素-α誘導(dǎo)蛋白6(interferon，alpha-inducible protein

8、6，IFI6)，干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白1(interferoninduced transmembrane protein1，IFITM1)等共846個(gè)差異基因。目前有確定基因名稱(chēng)的共有556個(gè)，其中上升的有299個(gè)基因，下降的基因有257個(gè)基因。
　　 2.經(jīng)分析差異基因主要參與如下幾條通路：促性腺激素釋放激素信號(hào)通路，細(xì)胞外基質(zhì)受體的相互作用，粘附途徑，ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)運(yùn)載體，長(zhǎng)時(shí)

9、程增效作用，白細(xì)胞遷移作用，谷氨酸代謝，鈣信號(hào)通路，氮代謝通路。
　　 3.經(jīng)分析差異基因的基因本體(Gene Ontology，GO)富集于以下幾個(gè)方面：免疫過(guò)程，免疫應(yīng)答，配體依賴(lài)的核受體，終端紐，軸突組成部分，質(zhì)膜組成部分，類(lèi)固醇激素受體，體液平衡的調(diào)節(jié)。
　　 4.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示干擾素-α誘導(dǎo)蛋白27(interferon，alpha-inducible protein27，IFI27)，干擾素誘導(dǎo)蛋白4

10、4(interferon-induced protein44，IFI44)，IFITM1，干擾素誘導(dǎo)的17-KD蛋白(Interferon-induced17kDaprotein，ISG15)，IFI6這五個(gè)基因與芯片結(jié)果的趨勢(shì)一致，均顯示DEN感染組較未感染組表達(dá)升高。而在非差異基因的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果中顯示：X連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1(X-linked inhibitor ofapoptosis associated factor

11、1，XAF1)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducers and activators oftranscriptionl，STAT)這兩個(gè)基因表現(xiàn)為感染組相對(duì)于未感染組呈上升趨勢(shì)，細(xì)胞分裂周期蛋白20(cell division cycle20homolog，CDC20)，基質(zhì)金屬蛋白酶-14(matrix metallopeptidase14，MMP14)，小窩蛋白2(caveolin2，CAV2)這三個(gè)基因在實(shí)

12、時(shí)定量結(jié)果中表達(dá)量均無(wú)大的變化。趨化因子(C-X-C基序)受體4(chemokine(C-X-C motif)receptor4CXCR4)，干擾素誘導(dǎo)蛋白p78(myxovirus resistance1，MX1)，干擾素調(diào)節(jié)因子7(Interferon regulatory factor7，IRF7)表達(dá)量過(guò)低，超出檢測(cè)范圍。
　　 結(jié)論：
　　 1.登革病毒感染HUVEC后可引起多個(gè)基因表達(dá)發(fā)生改變，其中干擾素誘導(dǎo)