剪應(yīng)力和血管內(nèi)皮生長因子對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響.pdf

1、研究背景：
　　治療性血管新生即將外源性的血管生成細(xì)胞或血管生成因子導(dǎo)入缺血組織中，促進(jìn)局部的血管新生和側(cè)枝循環(huán)形成,從而達(dá)到治療缺血性疾病的目的，是近年來提出的治療缺血性疾病特別是缺血性心臟病的新概念。目前的研究主要集中于選擇何種血管生成細(xì)胞及如何獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞以保證最佳的治療效果，干細(xì)胞是血管生成細(xì)胞重要的來源。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一類存在于骨髓基質(zhì)內(nèi)的非造血干細(xì)胞來源的細(xì)胞亞群。MSCs具有容易分離

2、培養(yǎng)、多向分化能力、免疫排斥反應(yīng)小的特點(diǎn)，已經(jīng)成為構(gòu)建組織工程十分重要的種子細(xì)胞。MSCs生長的生物化學(xué)環(huán)境和復(fù)雜的生物力學(xué)環(huán)境對(duì)其分化和表型表達(dá)有重要的影響。MSCs可以在體外擴(kuò)增并可經(jīng)不同條件誘導(dǎo)后分化為內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞。而內(nèi)皮細(xì)胞是導(dǎo)致血管新生的重要細(xì)胞，在體外血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、IGF-1、ECGS等細(xì)胞因子單獨(dú)或聯(lián)合的誘導(dǎo)下MSCs

3、可以向內(nèi)皮細(xì)胞分化，使其成為一種可能用于治療性血管新生的細(xì)胞來源。此外，因其體外可大量擴(kuò)增，有望解決血管內(nèi)皮細(xì)胞來源不足的問題。但各種細(xì)胞因子普遍價(jià)格昂貴，以及潛在的細(xì)胞生物安全性問題未得到解決。而相對(duì)細(xì)胞因子的化學(xué)環(huán)境，生物力學(xué)環(huán)境對(duì)MSCs影響的研究仍處于起步階段。血流剪應(yīng)力是血管內(nèi)皮細(xì)胞成熟并保持功能的不可缺少的促進(jìn)因素，已有研究表明[8]，剪應(yīng)力可以誘導(dǎo)了胚胎干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞兩類干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化。因此提示剪應(yīng)力也可能誘導(dǎo)M

4、SCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化。
　　目的：
　　本研究擬探討在體外培養(yǎng)的條件下，VEGF和剪應(yīng)力對(duì)人MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響。
　　方法：
　　第一部分MSCs的分離培養(yǎng)和鑒定
　　1.取健康成人骨髓，密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離MSCs，體外培養(yǎng)并傳代。
　　2.光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　3.用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44對(duì)MSCs進(jìn)行鑒定。
　　第二部分VEGF對(duì)MSCs向內(nèi)皮細(xì)

5、胞分化的影響
　　將培養(yǎng)得到的MSCs分為對(duì)照組和VEGF誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)組給予10μg/LVEGF作用。分別于誘導(dǎo)24小時(shí)（h）、7天（d）后觀察細(xì)胞形態(tài)變化，采用間接免疫熒光染色法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物VonWillebrandfactor(vWF)的表達(dá)情況，用Dil標(biāo)記的乙?；疞DL（Dil-Ac-LDL）攝取實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)攝取功能。
　　第三部分剪應(yīng)力對(duì)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響
　　將培養(yǎng)得到的MSCs分為

6、對(duì)照組和剪應(yīng)力誘導(dǎo)組（8、15dyn/cm2），誘導(dǎo)組在平行平板流動(dòng)腔裝置中施加剪應(yīng)力。誘導(dǎo)24h后觀察細(xì)胞形態(tài)變化、vWF表達(dá)情況以及Dil-Ac-LDL攝取功能。
　　第四部分剪應(yīng)力聯(lián)合VEGF對(duì)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響
　　將培養(yǎng)得到的MSCs分為對(duì)照組、剪應(yīng)力聯(lián)合誘導(dǎo)組（8、15dyn/cm2）與VEGF（10μg/L）聯(lián)合誘導(dǎo)組。誘導(dǎo)24h后觀察細(xì)胞形態(tài)變化，vWF表達(dá)情況以及Dil-Ac-LDL攝取功能。

7、r>　　結(jié)果：
　　1.分離培養(yǎng)得到的MSCs形態(tài)呈長梭形，免疫組化染色顯示CD44陽性，證明培養(yǎng)細(xì)胞為MSCs。
　　2.與對(duì)照組相比，VEGF誘導(dǎo)24h后MSCs形態(tài)無明顯變化，vWF染色陰性，Dil-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)陰性。VEGF誘導(dǎo)7d后MSCs形態(tài)呈扁圓或多角形，類似內(nèi)皮細(xì)胞，vWF染色陽性，Dil-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)陽性，提示MSCs已分化為內(nèi)皮細(xì)胞。
　　3.與對(duì)照組相比，8dyn/cm2剪應(yīng)力作用

8、24h后，MSCs呈扁圓或多角形，vWF染色弱陽性，Dil-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)陽性，提示MSCs已分化為內(nèi)皮細(xì)胞。而15dyn/cm2剪應(yīng)力作用24h后，vWF染色與Dil-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)均陰性，提示MSCs未向內(nèi)皮細(xì)胞分化。
　　4.與單獨(dú)剪應(yīng)力作用組相比，剪應(yīng)力與VEGF聯(lián)合作用24h后，細(xì)胞密度明顯增大，vWF染色強(qiáng)陽性，Dil-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)陽性，提示MSCs不僅分化為內(nèi)皮細(xì)胞，而且發(fā)生增殖。
　　結(jié)論