LMWH對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能和細(xì)胞周期的影響.pdf

1、目的：廣泛的血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷是妊娠期高血壓疾病發(fā)病機(jī)理的一個(gè)中心環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素(ET)可作為反映其功能的指標(biāo)。子癇前期是妊娠期高血壓疾病的一種，研究表明，NO和ET的變化與子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)。低分子肝素(LMWH)已經(jīng)較廣泛應(yīng)用于臨床，但對(duì)于其非抗凝機(jī)制方面的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外研究較少。本課題用子癇前期患者及正常晚孕婦女的血清與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞株在體外共培養(yǎng)，然后用LMW

2、H進(jìn)行干預(yù)治療，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、免疫組化、流式細(xì)胞技術(shù)等方法，檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、ET及細(xì)胞周期的變化，旨在為L(zhǎng)MWH治療妊娠期高血壓疾病提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 方法：研究對(duì)象分為兩組：子癇前期患者組18例，對(duì)照組為正常晚期妊娠婦女12例。兩組孕婦于入院后(子癇前期患者于藥物治療前)采空腹肘靜脈血5m1，離心后收集血清備用。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304分3次接種于15個(gè)6孔培養(yǎng)板(預(yù)先放

3、入經(jīng)過(guò)處理的無(wú)菌蓋玻片)，每3孔加入含20％同一份婦女血清的培養(yǎng)液，在37℃，5％CO<,2>條件下共同孵育48小時(shí)后，把用相同血清培養(yǎng)后的ECV304按隨機(jī)原則給予以下3種處理：兩孔加入LMWH，使其終濃度分別為1U/ml和2U/ml；另1孔加入等體積的培養(yǎng)液。繼續(xù)孵育24小時(shí)后，取出蓋玻片行免疫組化，檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞ET表達(dá)的變化，用胰蛋白酶消化法收集內(nèi)皮細(xì)胞，分別運(yùn)用RT-PCR法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS-mRNA的表達(dá)與細(xì)胞

4、周期的變化。 結(jié)果：①子癇前期患者血清培養(yǎng)后，內(nèi)皮細(xì)胞eNOS-mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，ET表達(dá)明顯增高(P<0.05)。內(nèi)皮細(xì)胞受患者血清刺激后，G<,1>期進(jìn)入S期和G<,2>期的細(xì)胞百分比減少，G<,1>期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多(P<0.05)，S期和G<,2>期細(xì)胞均減少(P<0.05)。②LMwH干預(yù)后，無(wú)論是正常血清組還是患者血清組，內(nèi)皮細(xì)胞eNOS-mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)，并且不同濃度間有顯著性差異，呈劑量

5、依賴(lài)性。正常血清組中，高濃度LMwH更能顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)eNOS-mRNA的表達(dá)(P<0.01)；患者血清組中，高濃度LMWH也比低濃度LMWH使eNOS-mRNA增加明顯(P<0.05)。低濃度LMWH時(shí)，正常血清組和患者血清組內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)eNOS-mRNA的水平無(wú)明顯差異(P>0.05)；高濃度LMWH時(shí)，其表達(dá)的eNOS-mRNA有差異，并且正常血清組增加更顯著，(P<0.05)。③LMWH干預(yù)后，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ET的表達(dá)無(wú)明顯差異

6、，且不同濃度間亦無(wú)差異(P>0.05)。④LMWH對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞各周期也有一定的影響。LMWH使患者血清組G<,1>期進(jìn)入S期和G<,2>期的細(xì)胞百分比增加(P<0.05)，但不同濃度間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；正常血清組中，細(xì)胞周期無(wú)明顯變化(P>0.05)。 結(jié)論：①子癇前期患者血清可降低體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞eNOS-mRNA的表達(dá)，增加ET表達(dá)，減少S期和G<,2>期的細(xì)胞百分比。②LMWH干預(yù)后，用正常晚孕婦女和患者血

7、清培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞eNOS-mRNA表達(dá)均升高，并呈劑量依賴(lài)性，且在高濃度LMWH時(shí)，正常血清組內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)eNOS-mRNA的表達(dá)增加更明顯；LMWH干預(yù)后，ET的表達(dá)無(wú)顯著性差異；但結(jié)合LMWH能增加患者血清組內(nèi)皮細(xì)胞S期和G<,2>期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，推測(cè)LMWH能抑制子癇前期患者血清組內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)ET的表達(dá)。③本研究提示LMWH能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)eNOS的分泌，并在一定程度上調(diào)節(jié)患者血清培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞周期。由此推斷，LMWH可能通過(guò)調(diào)整NO