Ghrelin及Ghrelin(1-7)-NH2的中樞鎮(zhèn)痛作用和鎮(zhèn)痛機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　內(nèi)源性腦腸肽ghrelin作為近年來研究的熱點(diǎn)，其對(duì)痛覺系統(tǒng)的重要作用引起了我們極大的關(guān)注。我們前期研究結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射ghrelin能對(duì)小鼠急性痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，但其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制仍不清楚。另一方面，針對(duì)ghrelin合成困難，成本高等問題篩選出來的ghrelin活性片段ghrelin(1-7)-NH2引起了我們的重視。本課題擬研究ghrelin的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制和ghrelin(1-7)-NH2的鎮(zhèn)痛活性以及機(jī)制，為后

2、續(xù)相關(guān)鎮(zhèn)痛研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　采用溫浴甩尾方法來研究 ghrelin與各阿片受體的關(guān)系，探究ghrelin(1-7)-NH2的鎮(zhèn)痛活性以及與阿片系統(tǒng)的關(guān)系；采用熒光標(biāo)記方法研究ghrelin及ghrelin(1-7)-NH2分別產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的中樞確切位點(diǎn)；采用RT-PCR、Western blot方法研究相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：
　　1、側(cè)腦室單獨(dú)注射β-FNA（β-funaltre

3、xamine，μ-阿片受體特異性拮抗劑）， NTI（Naltrindole，δ-阿片受體特異性拮抗劑），nor-BNI（nor-binaltorphimine，κ-阿片受體特異性拮抗劑）均不能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，而分別與ghrelin共注射時(shí)， NTI能完全拮抗ghrelin的鎮(zhèn)痛作用（P<0.001），另外兩個(gè)拮抗劑都不能拮抗ghrelin的鎮(zhèn)痛作用（P>0.05）。
　　2、側(cè)腦室注射FAM-ghrelin來確定目標(biāo)肽注射后在中樞的

4、分布，結(jié)果顯示FAM-ghrelin經(jīng)側(cè)腦室注射后主要分布在側(cè)腦室周圍，外側(cè)隔閡，第三腦室周圍，齒狀回，海馬等位置。
　　3、RT-PCR結(jié)果顯示，注射ghrelin后PENK mRNA（Proenkephalin）和OPRD（Delta opioid receptor）mRNA表達(dá)水平均有顯著性升高，而其他相關(guān)基因的表達(dá)與對(duì)照組相比并無明顯差異。
　　4、根據(jù)RT-PCR結(jié)果，我們進(jìn)一步開展Western blot檢測，結(jié)

5、果顯示與對(duì)照組相比，ghrelin注射后GHSR蛋白水平?jīng)]有明顯改變，但PENK蛋白和OPRD蛋白表達(dá)在20min內(nèi)均有顯著升高。
　　5、[D-Lys3]-GHRP-6（GHSR-1α特異性拮抗劑）和Deltorphin II（δ受體內(nèi)源性激動(dòng)劑）共注射組與Deltorphin II單獨(dú)注射組相比差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說明[D-Lys3]-GHRP-6不能拮抗Deltorphin II的中樞鎮(zhèn)痛作用。
　　

6、6、小鼠側(cè)腦室注射ghrelin(1-7)-NH2能產(chǎn)生時(shí)間-濃度依賴的鎮(zhèn)痛作用，而這一鎮(zhèn)痛作用能被[D-Lys3]-GHRP-6和納絡(luò)酮（阿片受體廣譜拮抗劑）完全拮抗。
　　7、FAM-ghrelin(1-7)-NH2經(jīng)側(cè)腦室注射后主要分布在中樞側(cè)腦室周圍，外側(cè)隔閡背側(cè)，胼胝體，第三腦室周圍，海馬，海馬裂，東方海馬體層等位置。
　　8、RT-PCR結(jié)果顯示，在注射ghrelin(1-7)-NH2后實(shí)驗(yàn)組PENK mRNA和

7、OPRD mRNA表達(dá)水平均有顯著升高（P<0.01），而其他受體配體mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　9、Western blot檢測結(jié)果顯示側(cè)腦室注射ghrelin(1-7)-NH2后，PENK蛋白和OPRD蛋白表達(dá)均有顯著升高，而GHSR蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比未見顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1、側(cè)腦室注射ghrelin(1-7)-NH2能產(chǎn)生時(shí)間-濃度依賴的鎮(zhèn)痛作用，并且作用明顯。
　　2、Gh

8、relin和ghrelin(1-7)-NH2側(cè)腦室注射后均主要分布在中樞腦室周圍；通過疼痛行為學(xué)和分子實(shí)驗(yàn)得出它們的鎮(zhèn)痛效應(yīng)是通過先激活GHSR-1α，然后使下游內(nèi)源性阿片肽PENK與其受體OPRD表達(dá)增多，進(jìn)而PENK與其受體OPRD結(jié)合來產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。
　　3、Ghrelin與ghrelin(1-7)-NH2的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制相似，中樞分布也大同小異，但ghrelin(1-7)-NH2合成簡單，成本低，有進(jìn)一步作為鎮(zhèn)痛藥物開發(fā)的潛