Ghrelin、Obestatin在慢性心衰中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、慢性心力衰竭是所有心血管疾病的終末狀態(tài)，發(fā)病率逐年上升，目前慢性心衰已成為心血管疾病死亡的最主要原因。重度心衰(NYHAⅣ)患者年病死率甚至可達(dá)到40％～50％。多種神經(jīng)體液因素對(duì)心衰左室重構(gòu)起調(diào)節(jié)作用，并對(duì)發(fā)展預(yù)后起到至關(guān)重要的作用，進(jìn)一步研究這些血管活性物質(zhì)的功能及作用機(jī)制已成為近年來(lái)新發(fā)展的一個(gè)學(xué)科分支心血管內(nèi)分泌學(xué)(cardiovascular endocrinology)的重要研究?jī)?nèi)容。
　　 Ghrelin與obes

2、tatin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的～組同源多肽激素。已知ghrelin是生長(zhǎng)激素促泌素受體(GHSR)的天然配體，已有一系列研究證實(shí)了ghrelin的促進(jìn)食欲、能量調(diào)節(jié)。心血管系統(tǒng)自身亦可合成和分泌ghrelin，且其受體GHSR亦廣泛分布于心血管系統(tǒng)，提示ghrelin在心血管系統(tǒng)中還可能具有旁分泌/自分泌功能，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。研究提示ghrelin可能是一個(gè)保護(hù)因子：①抑制冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)；②保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，抑制

3、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；③擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加心肌供血；④保護(hù)缺血及缺血再灌注引起的心肌損傷；⑤拈抗有害物質(zhì)對(duì)心肌的損傷，刺激心肌細(xì)胞增殖以及抑制心肌細(xì)胞的凋亡；⑥抑制血管及血管平滑肌細(xì)胞的鈣化；⑦拮抗心梗后交感神經(jīng)活性、早期改善心肌重構(gòu)、改善慢性心衰心功能及臨床癥狀等作用。
　　 Zhang等推測(cè)并證實(shí)了ghrelin前多肽原還可產(chǎn)生另外一種多肽，并命名為obestatin。這一同源多肽obestatin的功能尚不明確，對(duì)其在能量代謝、食

4、欲調(diào)節(jié)等方面的功能及GPR39是否是其受體一直存在爭(zhēng)議。而近期部分研究顯示obestatin具有促進(jìn)胰島細(xì)胞、視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞增值，抑制精氨酸加壓素分泌等活性。當(dāng)前關(guān)于Obestatin是否具有心血管活性，obestatin與ghrelin的關(guān)系及二者功能的協(xié)調(diào)與心衰、心源性惡液質(zhì)發(fā)展中交互作用和機(jī)制值得進(jìn)一步研究。因此，本研究擬從以下幾個(gè)方面探討在慢性心衰及其常見病因心肌梗死后發(fā)展過(guò)程中g(shù)hrelin和obestatin水平變化及其作用

5、；研究ghrelin和obestatin對(duì)代謝關(guān)鍵酶AMPK的作用，并初步探討其中機(jī)制，以期為目前相關(guān)問題的解決提供一些新的可能思路。1、慢性心衰患者，包括慢性心衰合并惡液質(zhì)患者空腹外周血obestatin水平的變化及其與ghrelin的關(guān)系。2、ghrelin和obestatin對(duì)H9C2、原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞的增殖、凋亡的影響，及對(duì)AMPK信號(hào)通路活化的作用。3、大鼠心梗后至至心衰階段不同時(shí)間點(diǎn)外周血ghrelin、obestat

6、in水平的變化及關(guān)系；obestatin注射對(duì)心衰大鼠心功能及體重影響。
　　 第一部分：慢性心衰患者外周血ghrelin、obestatin水平變化及意義
　　 目的：探討慢性心衰患者，包括慢性心衰合并惡液質(zhì)患者空腹外周血obestatin水平的變化及其與ghrelin的關(guān)系。
　　 方法：采用RIA法檢測(cè)65例慢性心衰患者(心源性惡液質(zhì)患者22例)和15例正常對(duì)照者空腹外周血ghrelin、obestatin

7、水平；同時(shí)采用RIA法檢測(cè)腦鈉肽(BNP)水平，并監(jiān)測(cè)體重指數(shù)、血糖、血脂、白細(xì)胞、肝腎功能及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。
　　 結(jié)果：慢性心衰合并心源性惡液質(zhì)患者空腹外周血ghrelin水平(1237.8±47.9pg/ml)明顯高于非惡液質(zhì)心衰患者(985.5±64.2 pg/ml，P=0.041)和正常對(duì)照(796.4±50.8 pg/ml，P＜0.01)。obestatin水平與ghrelin水平為正相關(guān)，在惡液質(zhì)患者中o

8、bestatin(282.3±13.0 pg/ml)顯著高于非惡液質(zhì)心衰者(163.1±9.2 pg/ml)及正常對(duì)照組(161.5±11.8 pg/ml，均P＜0.01)。但ghrelin/obestatin比值卻明顯低于正常對(duì)照組(4.5±0.2 vs6.3±0.3，P＜0.01)。相關(guān)分析顯示空腹ghrelin/obestatin比值(coefficient=-1.934，P=0.002)與ghrelin(coefficient=

9、0.01，P＜0.001)是惡液質(zhì)發(fā)展的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。而與年齡，性別，BNP水平，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，血肌酐水平等其它指標(biāo)間相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：慢性心衰合并心源性惡液質(zhì)患者ghrelin和obestatin水平均升高，但ghrelin/obestain比值下降，ghrelin和ghrelin/obestatin比值是惡液質(zhì)發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。慢性心衰尤其是進(jìn)展至惡液質(zhì)階段時(shí)存在明顯的循環(huán)ghrelin和obe

10、statin紊亂，外周血ghrelin、obestatin比例失衡可能參與慢性心衰尤其是心衰合并惡液質(zhì)的病理生理進(jìn)程。
　　 第二部分：Ghrelin、Obstatin對(duì)心肌細(xì)胞增殖/凋亡的作用及AMPK活化的調(diào)節(jié)關(guān)系
　　 目的：觀察ghrelin和obestatin對(duì)H9C2、原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞的作用：①obestatin對(duì)心肌細(xì)胞增殖、凋亡和ATP產(chǎn)生的影響；②ghrelin和obestatin對(duì)AMPK信號(hào)通

11、路活化的作用；并利用無(wú)GHSRla表達(dá)的H9C2細(xì)胞進(jìn)一步了解AMPK信號(hào)通路活化與GHSRla受體之間的關(guān)聯(lián)。③了解ghrelin、obestatin對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚的協(xié)同/拮抗作用。
　　 方法：MTT法檢測(cè)不同濃度(10-6～10-8mol/l)的ghrelin和obestatin12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)干預(yù)的H9C2細(xì)胞株增殖情況；Cell Titer-Glo Luminescent熒光試劑盒檢測(cè)ghreli

12、n和obesatin干預(yù)后48h后細(xì)胞內(nèi)ATP水平的變化；westem blot檢測(cè)obesatin和ghrelin干預(yù)原代心肌細(xì)胞0～4小時(shí)P-AMPK水平變化；Annexin V-FITC檢測(cè)體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞10-6mol/l的ghrelin和obestatin對(duì)阿霉素誘導(dǎo)凋亡的影響，并加入信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑Compound C(AMPK抑制物)檢測(cè)P-AMPK在ghrelin抗細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用；應(yīng)用10-6mol/l的g

13、hrelin、obestatin與血管緊張素(AngⅡ)分別及聯(lián)合干預(yù)原代心肌細(xì)胞，檢測(cè)0～4小時(shí)內(nèi)P-AMPK水平變化，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度、RT-PCR檢測(cè)Anf和β-MHCmRNA變化。
　　 結(jié)論：Obestatin對(duì)心肌細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程無(wú)明顯作用。ghrelin促進(jìn)H9C2細(xì)胞增殖，增加原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞的P-AMPK水平，并可通過(guò)AMPK通路抑制心肌細(xì)胞凋亡。Ghrelin短暫并部分拮抗AngⅡ?qū)-AMPK的抑制作用，

14、但對(duì)AngⅡ的ATP濃度調(diào)節(jié)及促心肌肥大蛋白合成過(guò)程無(wú)明顯影響；ghrelin對(duì)無(wú)GHSR1a受體表達(dá)的H9C2細(xì)胞P-AMPK水平無(wú)影響。提示ghrelin對(duì)AMPK這一重要能量代謝因子的調(diào)節(jié)與GHSR1a有關(guān)。
　　 第三部分：前降支結(jié)扎心梗大鼠外周血ghrelin、obestatin水平變化及意義
　　 目的：檢測(cè)前降支結(jié)扎心梗大鼠外周血ghrelin、obestatin水平的變化及關(guān)系；心梗至心衰后大鼠obest

15、atin注射2周后對(duì)大鼠心功能及體重影響。
　　 方法：建立經(jīng)前降支結(jié)扎至心肌梗死后心衰模型(n=12)，假手術(shù)組(n=6)。心衰經(jīng)超聲證實(shí)。檢測(cè)術(shù)前及術(shù)后到心衰(n=6)不同時(shí)間點(diǎn)血漿ghrelin、obestatin水平。心衰大鼠分為obestatin(100ug/Kg)注射組(n=6)和生理鹽水對(duì)照組(等量鹽水)(n=6)，在obstatin注射2周后用超聲檢測(cè)大鼠左室舒張末直徑(LVEDD)、左室收縮末直徑(LVESD)

16、、左室舒張末容積(LVEDV)、左室收縮末容積(LVESV)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、縮短率(FS)變化。
　　 結(jié)論：血漿Obstatin水平在大鼠心梗后24小時(shí)明顯降低，3天到4周持續(xù)明顯增加。血漿ghrelin水平在心梗后24小時(shí)也明顯降低，以后逐漸升高，心梗4周后才明顯增高。ghrelin/obestatin比值在心梗24小時(shí)明顯升高，以后逐漸降低，直到心梗2周后明顯降低。給心衰大鼠注射Obstatin并不能改善心功能。提