Ghrelin對TNF-α誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞PAI-1分泌干預(yù)作用及機(jī)制的研究.pdf

1、炎癥機(jī)制在1型糖尿病中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。在進(jìn)展為2型糖尿病的個(gè)體中，顯示在疾病開始之前的若干年前，這種人就顯示著低度炎癥狀態(tài)。處于這種低度炎癥狀態(tài)被認(rèn)為是導(dǎo)致2型糖尿病病理過程的部分原因。炎癥介質(zhì)，例如腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)等已經(jīng)被提出與此種因素有關(guān)，導(dǎo)致各種形式的糖尿病，胰島素抵抗。長時(shí)間的代謝異常導(dǎo)致了全身的血管并發(fā)癥，是動(dòng)脈硬化和心肌梗死等心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2、 炎癥標(biāo)記物C反應(yīng)性蛋白(C-reactive protein，CRP)、血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)等在肥胖的胰島素抵抗個(gè)體中濃度明顯增高。TNF-α在導(dǎo)致胰島素抵抗的代謝紊亂中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。 PAI-1是一單鏈糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑，是組織型纖溶酶原激活物(tissuetype plasminogen activator，tPA)的生

3、理性抑制劑，在維持機(jī)體的抗凝—促凝血平衡中起著重要的作用。目前認(rèn)為血漿中PAI-1增多是動(dòng)脈粥樣硬化等血管、血栓性疾病發(fā)生的主要原因之一。胰島素抵抗與血漿中PAI-1濃度有密切的相關(guān)性，PAI-1的增高依賴于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的存在。在代謝綜合征病人所見的加速的動(dòng)脈粥樣硬化過程不僅與異常的代謝有關(guān)，也與特異的炎癥狀態(tài)導(dǎo)致的升高的血漿PAI-1有關(guān)。PAI-1也可作為聯(lián)系炎癥和胰島素抵抗的橋梁。 肝臟在糖脂代謝中起重要的作用，是胰島素

4、抵抗發(fā)生的重要部位，也是PAI-1等急性期蛋白產(chǎn)生的主要器官之一。研究表明肝臟是脂肪和肌肉來源的TNF-α的關(guān)鍵靶器官。有證據(jù)顯示，在代謝綜合征表達(dá)PAI-1等蛋白上，TNF-α通路有特殊的作用。由此，我們可以通過制作炎癥因子TNF-α刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生PAI-1的模型，模擬胰島素抵抗個(gè)體低度炎癥狀態(tài)下，促炎癥因子對肝臟產(chǎn)生PAI-1的作用，以了解炎癥因子對肝細(xì)胞PAI-1產(chǎn)生的機(jī)制，為探討干預(yù)作用制造合理的模型。 核轉(zhuǎn)錄因子-κB

5、(nuclear factor-kappaB，NFκB)是一種轉(zhuǎn)錄激活子。刺激NFκB激活需要κB抑制蛋白(inhibitorsofκB，IκB)家族成員的順序磷酸化、泛素化、蛋白酶體依賴的IκBs降解和NFκB核定位信號(hào)的暴露，進(jìn)而與靶基因κB部位結(jié)合，調(diào)控特定基因轉(zhuǎn)錄，參與多種生物學(xué)反應(yīng)。TNF-α等多種信號(hào)可誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子NFκB的激活，在細(xì)胞炎癥反應(yīng)等過程中具有十分重要的作用。糖尿病和代謝綜合征等研究的深入證實(shí)，NFκB激活的在

6、胰島素抵抗個(gè)體中同樣存在，已成為慢性炎癥狀態(tài)的標(biāo)志物之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道TNF-α在體外可通過激活NFκB通路，刺激細(xì)胞PAI-1等蛋白產(chǎn)生。 越來越多的證據(jù)證明細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)、c-Jun氨基端激酶(c-Junaminoterminuskinase，JNK)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated prot

7、ein kinase，p38MAPK)等MAPK信號(hào)通路的激活卷入了TNF-α誘導(dǎo)的PAI-1產(chǎn)生。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/Akt通路的激活抑制PAI-1的產(chǎn)生。 Ghrelin是一種生長激素促分泌素受體(growthhormone secretagogue receptor，GHS-R)的內(nèi)源性配體，從小鼠和人的胃內(nèi)分泌細(xì)胞中分離出來的一種新的腦腸肽。對Ghr

8、elin作用的研究上，主要集中在促生長激素(growth hormone，GH)分泌方面。同時(shí)，其受體分布的廣泛性又決定Ghrelin可能具有更廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。 除對糖脂代謝有影響外，ghrelin還在許多組織如心血管和免疫等組織表達(dá)，在局部發(fā)揮作用。Ghrelin在血管內(nèi)皮細(xì)胞有抗炎保護(hù)功能的作用，發(fā)揮抗炎作用部分是通過抑制NFκB通路來實(shí)現(xiàn)。但也有報(bào)道顯示，ghrelin在結(jié)腸細(xì)胞能通過蛋白激酶C介導(dǎo)NFκB激活刺激IL-

9、8的產(chǎn)生而在發(fā)揮促炎因子的作用?？梢酝茢嘣趯ρ装Y的作用方面，ghrelin在不同的組織中發(fā)揮作用并不一致，需進(jìn)一步研究明確。 在肥胖的個(gè)體，空腹ghrelin的水平與胰島素抵抗和PAI-1水平顯著負(fù)相關(guān)。肝臟是血漿PAI-1主要的產(chǎn)生部位之一。Ghrelin受體在肝臟有表達(dá)，基于ghrelin對炎癥有調(diào)節(jié)作用，我們設(shè)想Ghrelin可能通過抑制NFκB的激活而抑制在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下炎癥因子誘導(dǎo)的肝臟PAI-1等蛋白分泌，對血漿的

10、PAI-1水平有下調(diào)作用，從而發(fā)揮機(jī)體保護(hù)作用，減緩胰島素抵抗個(gè)體的血管并發(fā)癥的進(jìn)展。故我們設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體外培養(yǎng)肝細(xì)胞系HepG2，給予促炎癥因子TNF-α刺激，誘導(dǎo)PAI-1的表達(dá)，給予ghrelin干預(yù)，檢測變化，研究ghrelin在肝臟部位的抗炎功能，為進(jìn)一步明確ghrelin的功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為可能的ghrelin應(yīng)用于臨床糖尿病血管并發(fā)癥的防治提供線索。同時(shí)我們也檢測了ghrelin對NFκB，MAPK，PI3K/Akt信

11、號(hào)通路蛋白磷酸化的作用，以期對ghrelin干預(yù)PAI-1分泌的機(jī)制進(jìn)行初步的探討。 HepG2細(xì)胞是高分化的人類肝癌細(xì)胞系，具有人肝細(xì)胞絕大多數(shù)的生物學(xué)功能和生化功能特征，如能產(chǎn)生急性期蛋白，對炎癥因子有反應(yīng)性等。與人肝細(xì)胞相比，HePG2細(xì)胞更容易獲得，并能傳代培養(yǎng)，已常規(guī)替代肝細(xì)胞作為研究肝細(xì)胞炎癥和代謝的模型。HepG2細(xì)胞表達(dá)促生長激素分泌激素受體GHS-R，對ghrelin有反應(yīng)，已用于ghrelin對胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

12、的研究，故可用此種細(xì)胞作為本研究的使用細(xì)胞。 方法： 1、HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)：將HepG2細(xì)胞用含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃，5％CO2的條件下在培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)，每兩天換液一次，待細(xì)胞處于亞融合狀態(tài)時(shí)，用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化液消化傳代。用于實(shí)驗(yàn)時(shí)，80-90％融合的細(xì)胞用消化液消化后，加入完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以1×106個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板。 2、細(xì)胞無血清

13、培養(yǎng)24h后，用不同濃度(0.1，1，10ng/ml)和時(shí)間(2h，6h，24h)TNF-α培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中PAI-1濃度，RT-PCR法檢測PAI-1mRNA表達(dá)。 3、Ghrelin單獨(dú)作用和與TNF-α聯(lián)合作用細(xì)胞，聯(lián)合作用時(shí)行g(shù)hrelin預(yù)處理1h后給予終濃度為1.0ng/ml的TNF-α培養(yǎng)24h后收取上清和細(xì)胞，檢測PAI-1的表達(dá)，同時(shí)檢測PAI-1mRNA的變化。 4、

14、用NFκB的特異性抑制劑PDTC預(yù)處理HepG2細(xì)胞1h，再給予終濃度為1.0ng/ml的TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)24h，同時(shí)設(shè)正常對照組，TNF-α組，ghrelin加PDTC預(yù)處理組，和PDTC單獨(dú)作用組。收集細(xì)胞和上清，檢測PAI-1蛋白和PAI-1mRNA的變化。 5、用濃度100ng/ml的ghrelin預(yù)處理細(xì)胞1h后加入10ng/ml的TNF-α，培養(yǎng)30min后，收集細(xì)胞分別提取胞漿蛋白和核蛋白，Westernblo

15、t檢測磷酸化的p38MAPK和ERK1/2，JNK，Akt，NFκBp65，IκBα，β-actin蛋白的表達(dá)。 6、Westernblot檢測PDTC預(yù)處理后NFκBp65和IκBα的表達(dá)。 7、用濃度100ng/ml的ghrelin預(yù)處理細(xì)胞1h后加入10ng/ml的TNF-α，培養(yǎng)細(xì)胞30min后，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測NFκBp65蛋白在HepG2細(xì)胞的定位。 結(jié)論： 1、TNF-α可提高HepG2

16、細(xì)胞PAI-1mRNA表達(dá)和蛋白分泌。 2、Ghrelin可抑制基礎(chǔ)和TNF-α誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞PAI-1mRNA表達(dá)和蛋白分泌。 3、Ghrelin可能通過抑制NFκB通路激活下調(diào)基礎(chǔ)和TNF-α誘導(dǎo)的PAI-1的表達(dá)。 4、Ghrelin可抑制TNF-α誘導(dǎo)的p38MAPK和JNK通路激活，可能通過此通路參與下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的PAI-1表達(dá)。 5、Ghrelin對PI3K/Akt通路有明顯的激活