Ghrelin對TNF-α誘導的HepG2細胞PAI-1分泌干預作用及機制的研究.pdf

1、炎癥機制在1型糖尿病中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。在進展為2型糖尿病的個體中，顯示在疾病開始之前的若干年前，這種人就顯示著低度炎癥狀態(tài)。處于這種低度炎癥狀態(tài)被認為是導致2型糖尿病病理過程的部分原因。炎癥介質(zhì)，例如腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)等已經(jīng)被提出與此種因素有關(guān)，導致各種形式的糖尿病，胰島素抵抗。長時間的代謝異常導致了全身的血管并發(fā)癥，是動脈硬化和心肌梗死等心血管疾病的獨立危險因素。

2、 炎癥標記物C反應性蛋白(C-reactive protein，CRP)、血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)等在肥胖的胰島素抵抗個體中濃度明顯增高。TNF-α在導致胰島素抵抗的代謝紊亂中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。 PAI-1是一單鏈糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑，是組織型纖溶酶原激活物(tissuetype plasminogen activator，tPA)的生

3、理性抑制劑，在維持機體的抗凝—促凝血平衡中起著重要的作用。目前認為血漿中PAI-1增多是動脈粥樣硬化等血管、血栓性疾病發(fā)生的主要原因之一。胰島素抵抗與血漿中PAI-1濃度有密切的相關(guān)性，PAI-1的增高依賴于胰島素抵抗狀態(tài)的存在。在代謝綜合征病人所見的加速的動脈粥樣硬化過程不僅與異常的代謝有關(guān)，也與特異的炎癥狀態(tài)導致的升高的血漿PAI-1有關(guān)。PAI-1也可作為聯(lián)系炎癥和胰島素抵抗的橋梁。 肝臟在糖脂代謝中起重要的作用，是胰島素

4、抵抗發(fā)生的重要部位，也是PAI-1等急性期蛋白產(chǎn)生的主要器官之一。研究表明肝臟是脂肪和肌肉來源的TNF-α的關(guān)鍵靶器官。有證據(jù)顯示，在代謝綜合征表達PAI-1等蛋白上，TNF-α通路有特殊的作用。由此，我們可以通過制作炎癥因子TNF-α刺激肝細胞產(chǎn)生PAI-1的模型，模擬胰島素抵抗個體低度炎癥狀態(tài)下，促炎癥因子對肝臟產(chǎn)生PAI-1的作用，以了解炎癥因子對肝細胞PAI-1產(chǎn)生的機制，為探討干預作用制造合理的模型。 核轉(zhuǎn)錄因子-κB

5、(nuclear factor-kappaB，NFκB)是一種轉(zhuǎn)錄激活子。刺激NFκB激活需要κB抑制蛋白(inhibitorsofκB，IκB)家族成員的順序磷酸化、泛素化、蛋白酶體依賴的IκBs降解和NFκB核定位信號的暴露，進而與靶基因κB部位結(jié)合，調(diào)控特定基因轉(zhuǎn)錄，參與多種生物學反應。TNF-α等多種信號可誘導核轉(zhuǎn)錄因子NFκB的激活，在細胞炎癥反應等過程中具有十分重要的作用。糖尿病和代謝綜合征等研究的深入證實，NFκB激活的在

6、胰島素抵抗個體中同樣存在，已成為慢性炎癥狀態(tài)的標志物之一。已有文獻報道TNF-α在體外可通過激活NFκB通路，刺激細胞PAI-1等蛋白產(chǎn)生。 越來越多的證據(jù)證明細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)、c-Jun氨基端激酶(c-Junaminoterminuskinase，JNK)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated prot

7、ein kinase，p38MAPK)等MAPK信號通路的激活卷入了TNF-α誘導的PAI-1產(chǎn)生。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/Akt通路的激活抑制PAI-1的產(chǎn)生。 Ghrelin是一種生長激素促分泌素受體(growthhormone secretagogue receptor，GHS-R)的內(nèi)源性配體，從小鼠和人的胃內(nèi)分泌細胞中分離出來的一種新的腦腸肽。對Ghr

8、elin作用的研究上，主要集中在促生長激素(growth hormone，GH)分泌方面。同時，其受體分布的廣泛性又決定Ghrelin可能具有更廣泛的生物學效應。 除對糖脂代謝有影響外，ghrelin還在許多組織如心血管和免疫等組織表達，在局部發(fā)揮作用。Ghrelin在血管內(nèi)皮細胞有抗炎保護功能的作用，發(fā)揮抗炎作用部分是通過抑制NFκB通路來實現(xiàn)。但也有報道顯示，ghrelin在結(jié)腸細胞能通過蛋白激酶C介導NFκB激活刺激IL-

9、8的產(chǎn)生而在發(fā)揮促炎因子的作用?？梢酝茢嘣趯ρ装Y的作用方面，ghrelin在不同的組織中發(fā)揮作用并不一致，需進一步研究明確。 在肥胖的個體，空腹ghrelin的水平與胰島素抵抗和PAI-1水平顯著負相關(guān)。肝臟是血漿PAI-1主要的產(chǎn)生部位之一。Ghrelin受體在肝臟有表達，基于ghrelin對炎癥有調(diào)節(jié)作用，我們設想Ghrelin可能通過抑制NFκB的激活而抑制在胰島素抵抗狀態(tài)下炎癥因子誘導的肝臟PAI-1等蛋白分泌，對血漿的

10、PAI-1水平有下調(diào)作用，從而發(fā)揮機體保護作用，減緩胰島素抵抗個體的血管并發(fā)癥的進展。故我們設計實驗進行體外培養(yǎng)肝細胞系HepG2，給予促炎癥因子TNF-α刺激，誘導PAI-1的表達，給予ghrelin干預，檢測變化，研究ghrelin在肝臟部位的抗炎功能，為進一步明確ghrelin的功能提供實驗依據(jù)，也為可能的ghrelin應用于臨床糖尿病血管并發(fā)癥的防治提供線索。同時我們也檢測了ghrelin對NFκB，MAPK，PI3K/Akt信

11、號通路蛋白磷酸化的作用，以期對ghrelin干預PAI-1分泌的機制進行初步的探討。 HepG2細胞是高分化的人類肝癌細胞系，具有人肝細胞絕大多數(shù)的生物學功能和生化功能特征，如能產(chǎn)生急性期蛋白，對炎癥因子有反應性等。與人肝細胞相比，HePG2細胞更容易獲得，并能傳代培養(yǎng)，已常規(guī)替代肝細胞作為研究肝細胞炎癥和代謝的模型。HepG2細胞表達促生長激素分泌激素受體GHS-R，對ghrelin有反應，已用于ghrelin對胰島素信號轉(zhuǎn)導

12、的研究，故可用此種細胞作為本研究的使用細胞。 方法： 1、HepG2細胞的培養(yǎng)：將HepG2細胞用含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃，5％CO2的條件下在培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)，每兩天換液一次，待細胞處于亞融合狀態(tài)時，用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化液消化傳代。用于實驗時，80-90％融合的細胞用消化液消化后，加入完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，以1×106個細胞/孔接種于6孔板。 2、細胞無血清

13、培養(yǎng)24h后，用不同濃度(0.1，1，10ng/ml)和時間(2h，6h，24h)TNF-α培養(yǎng)HepG2細胞，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中PAI-1濃度，RT-PCR法檢測PAI-1mRNA表達。 3、Ghrelin單獨作用和與TNF-α聯(lián)合作用細胞，聯(lián)合作用時行g(shù)hrelin預處理1h后給予終濃度為1.0ng/ml的TNF-α培養(yǎng)24h后收取上清和細胞，檢測PAI-1的表達，同時檢測PAI-1mRNA的變化。 4、

14、用NFκB的特異性抑制劑PDTC預處理HepG2細胞1h，再給予終濃度為1.0ng/ml的TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)24h，同時設正常對照組，TNF-α組，ghrelin加PDTC預處理組，和PDTC單獨作用組。收集細胞和上清，檢測PAI-1蛋白和PAI-1mRNA的變化。 5、用濃度100ng/ml的ghrelin預處理細胞1h后加入10ng/ml的TNF-α，培養(yǎng)30min后，收集細胞分別提取胞漿蛋白和核蛋白，Westernblo

15、t檢測磷酸化的p38MAPK和ERK1/2，JNK，Akt，NFκBp65，IκBα，β-actin蛋白的表達。 6、Westernblot檢測PDTC預處理后NFκBp65和IκBα的表達。 7、用濃度100ng/ml的ghrelin預處理細胞1h后加入10ng/ml的TNF-α，培養(yǎng)細胞30min后，免疫細胞化學方法檢測NFκBp65蛋白在HepG2細胞的定位。 結(jié)論： 1、TNF-α可提高HepG2

16、細胞PAI-1mRNA表達和蛋白分泌。 2、Ghrelin可抑制基礎和TNF-α誘導的HepG2細胞PAI-1mRNA表達和蛋白分泌。 3、Ghrelin可能通過抑制NFκB通路激活下調(diào)基礎和TNF-α誘導的PAI-1的表達。 4、Ghrelin可抑制TNF-α誘導的p38MAPK和JNK通路激活，可能通過此通路參與下調(diào)TNF-α誘導的PAI-1表達。 5、Ghrelin對PI3K/Akt通路有明顯的激活