DEC1對成骨代謝的作用及機制研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種以骨量減少和骨微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，導(dǎo)致骨的脆性增加，以致于易發(fā)生骨折的一種全身性代謝性骨病。研究發(fā)現(xiàn)，我國骨質(zhì)疏松癥患病率在6.6％-19.3％。中國已進入人口老齡化社會，隨著骨質(zhì)疏松患者增加、癥狀又有加重的趨勢，預(yù)計在未來骨折數(shù)量將日益增加，這對醫(yī)學、社會、經(jīng)濟各方面將帶來嚴重后果。因此對骨質(zhì)疏松癥的防治已成為世界性的重要衛(wèi)生問題。研究該疾病的發(fā)病原因、發(fā)病機制，研制新型的預(yù)防和治療藥

2、物，選擇和建立適宜的動物和細胞模型對開展骨質(zhì)疏松病因研究有重要作用。
　　1997年自人類軟骨細胞中分離得到的DEC1(differentiated embryo-chondrocyte expressed gene1)，屬于生長發(fā)育基因。DEC1蛋白廣泛表達于多數(shù)正常組織，包括軟骨、肺、心臟、肝、脾、腎、腸。DEC1參與許多生理過程，如軟骨形成、神經(jīng)發(fā)生、免疫應(yīng)答、生物節(jié)律、脂質(zhì)形成、腫瘤的發(fā)生等。但是，DEC1在骨質(zhì)疏松疾病發(fā)

3、展過程中扮演的角色如何，DEC1能否影響成骨細胞功能活性的改變，目前尚未見報道。
　　本研究工作從整體和離體水平研究了DEC1對骨代謝的影響，并探討了DEC1可能的作用機制。本文的第一部分工作首先構(gòu)建了雙側(cè)卵巢切除和長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素兩種不同誘因引發(fā)的骨質(zhì)疏松模型小鼠。我們發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，DEC1基因在兩種骨質(zhì)疏松造模小鼠骨髓腔中表達均有明顯下降。當我們進一步構(gòu)建DEC1基因敲除小鼠，對其四肢骨取樣檢測，發(fā)現(xiàn)與同齡野生小鼠相比

4、，骨量存在明顯下降?；谝陨辖Y(jié)果提示的DEC1基因與骨骼發(fā)育存在的密切關(guān)系，我們開展了第二部分工作。我們建立了糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids，GCs)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松細胞模型，并以淫羊藿苷(Icariin，ICA)作為陽性對照藥物干預(yù)，在此過程中我們發(fā)現(xiàn)了DEC1蛋白的高表達與成骨細胞分化活性增強存在著緊密聯(lián)系。另外，對SaoS-2細胞進行DEC1基因的過表達與敲除實驗進一步證實DEC1基因的成骨促進作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，D

5、EC1通過PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路實現(xiàn)對成骨細胞活性的調(diào)節(jié)。
　　第一部分在體研究:DEC1在兩種不同小鼠骨質(zhì)疏松模型中的作用以及DEC1敲除鼠骨表型
　　目的:隨著骨質(zhì)疏松患者增加、癥狀又有加重的趨勢，對骨質(zhì)疏松的防治已成為一個世界性的重要衛(wèi)生問題之一。有研究顯示DEC1與軟骨細胞發(fā)育分化過程關(guān)系密切，本部分探討DEC1在兩種骨質(zhì)疏松小鼠模型中的表達模式，以期拓寬DEC1在骨代謝研究領(lǐng)域的研究，

6、揭示骨質(zhì)疏松疾病發(fā)生、發(fā)展的新途徑，為臨床上對骨質(zhì)疏松的治療提供新思路。
　　方法:(1)構(gòu)建兩種不同的骨質(zhì)疏松小鼠模型:a.8周齡雌性小鼠雙側(cè)卵巢切除模擬女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis，PMOP);b.8周齡雄性小鼠皮下植入5mg，60d潑尼松龍(Prednisolone，PDL)緩釋片模擬糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥(Glucocorticoids induced osteoporo

7、sis，GCOP)。不同模型(PMOP、GCOP)小鼠分別對應(yīng)給予小劑量雌二醇(Estradiol，E2)替代治療，和淫羊藿苷藥物干預(yù)治療。造模和干預(yù)結(jié)束后處死小鼠，提取小鼠四肢骨進行組織形態(tài)學，免疫學和顯微CT檢測。(2)制備DEC1基因敲除小鼠，檢測四肢骨骨量變化。
　　結(jié)果:(1)與假手術(shù)組相比，不同方法制備的骨質(zhì)疏松模型小鼠骨髓腔中均存在DEC1蛋白表達量的減少(p＜0.05)。(2)治療組與骨質(zhì)疏松組相比較，DEC1蛋白

8、表達量有所回升(p＜0.05)。(3) DEC1基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，存在明顯的骨質(zhì)疏松樣表型(p＜0.05)。
　　結(jié)論:小鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與DEC1表達量的減少有關(guān)。
　　第二部分離體研究:DEC1激活PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路增加成骨細胞分化活性
　　目的:本文第一部分實驗數(shù)據(jù)顯示，在整體動物模型上DEC1減少與骨量下降有直接關(guān)聯(lián)。第二部分內(nèi)容在細胞水平驗證糖皮質(zhì)激素對成骨活性

9、的影響，并研究DEC1在此過程中扮演的角色，以期在分子水平闡明DEC1對成骨分化的作用機制。
　　方法:(1)給予類SaoS-2類成骨細胞株大劑量地塞米松(Dexamethasone，DEX)藥物干預(yù)，模擬成骨抑制的細胞模型。檢測該細胞模型下各種成骨表型標記物的變化以及DEC1蛋白水平的表達改變;對上述細胞模型給予淫羊藿苷藥物治療，檢測相關(guān)指標的變化。(2)檢測地塞米松干預(yù)下，SaoS-2細胞中的成骨關(guān)鍵信號β-catenin及其

10、上游信號變化。(3)構(gòu)建高表達DEC1的SaoS-2細胞模型，檢測成骨表型及其相關(guān)成骨信號通路變化。(4)構(gòu)建低表達DEC1的SaoS-2細胞模型，檢測成骨表型及其相關(guān)成骨信號通路變化。
　　結(jié)果:(1)地塞米松干擾SaoS-2細胞的分化過程，表現(xiàn)為堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性降低，染色減少、體外礦化結(jié)節(jié)形成減少、關(guān)鍵成骨蛋白Runt-related transcription factor2

11、(Runx2)表達減少(p＜0.05);同時DEC1蛋白表達降低，且糖皮質(zhì)激素的用量呈線性相關(guān)。(2)淫羊藿苷治療糾正了地塞米松組誘導(dǎo)的SaoS-2細胞的成骨活性的下降;并且回升DEC1的蛋白表達含量(p＜0.05)。(3)地塞米松抑制β-catenin的蛋白表達以及核轉(zhuǎn)位;DEC1在細胞核中的表達與β-catenin的表達模式存在正相關(guān)性(p＜0.05)。(4) DEC1過表達促進SaoS-2細胞的成骨分化過程;DEC1過表達同時促進