乳鐵蛋白的成骨作用機(jī)制及熱處理對其活性影響研究.pdf

1、乳鐵蛋白是一種具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多功能性鐵結(jié)合糖蛋白,它廣泛存在于哺乳動物乳汁中,一些外分泌物如淚液、滑液、唾液等也含有少量乳鐵蛋白。近年來發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白對骨生長和代謝的作用逐漸成為研究熱點。本研究從新鮮牛乳中分離純化得到乳鐵蛋白,研究乳鐵蛋白對成骨細(xì)胞增殖作用影響,考察乳鐵蛋白對成骨細(xì)胞MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響,同時研究不同加熱處理參數(shù)對乳鐵蛋白成骨活性影響及對成骨細(xì)胞MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響,進(jìn)而為乳鐵蛋白在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)

2、用工藝開發(fā)奠定一定的理論基礎(chǔ)。
　　本研究以新鮮牛乳為原料,通過脫脂、除酪蛋白、SP Sepharose Big Bead離子交換層析、Superdex200凝膠層析、超濾除鹽濃縮及真空冷凍干燥等一系列過程,最終獲得乳鐵蛋白純品。在純化過程中對Superdex200層析條件進(jìn)行優(yōu)化,通過優(yōu)化條件來分離純化乳鐵蛋白,得到乳鐵蛋白分子量約為76kDa,乳鐵蛋白純度約為93.82％,得率為68.19%。通過差示掃描量熱法測定得到的乳鐵蛋

3、白熱變性溫度為70.4℃和88.2℃。綜合考慮乳鐵蛋白熱變性溫度及實際生產(chǎn)加工中乳的熱處理參數(shù),設(shè)置以下加熱參數(shù):62-65℃加熱處理30min、72℃加熱處理10s、85℃加熱處理10min、95℃加熱處理10min對乳鐵蛋白進(jìn)行熱處理,進(jìn)而考察熱處理對乳鐵蛋白活性的影響。
　　從新生SD乳鼠中提取成骨細(xì)胞,通過形態(tài)觀察、HE染色、堿性磷酸酶染色及礦化結(jié)節(jié)染色來鑒定成骨細(xì)胞。運(yùn)用MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖實驗,比較不同加熱處理乳鐵蛋白

4、對成骨細(xì)胞增殖影響。研究結(jié)果表明未加熱乳鐵蛋白能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,且在生理濃度(1-100μg/mL)范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系。與未加熱乳鐵蛋白對成骨細(xì)胞增殖作用相比,62-65℃加熱處理低濃度乳鐵蛋白(1、10、50μg/mL)對成骨細(xì)增殖作用無顯著變化,而處理高濃度乳鐵蛋白(1000、1250、1500μg/mL)則會顯著降低對成骨細(xì)胞增殖作用;72℃加熱處理乳鐵蛋白對成骨細(xì)胞作用,作用24h時,低濃度(1、10μg/mL)對成骨細(xì)

5、胞增殖作用顯著提高,作用48、72h時則無顯著變化,72℃加熱處理高濃度乳鐵蛋白(1000、1250、1500μg/mL),作用24h、48h會顯著降低對成骨細(xì)胞增殖作用,作用72h則無顯著作用;85℃加熱處理和95℃加熱處理濃度高于50μg/mL乳鐵蛋白都會顯著降低對成骨細(xì)胞增殖作用。
　　研究乳鐵蛋白對成骨細(xì)胞MAPK信號通路影響發(fā)現(xiàn):乳鐵蛋白可通過介導(dǎo)ERK1/2、p38MAPK、JNK亞通路來促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,通過介導(dǎo)ER