DLL1在BMP9誘導MSCs成骨分化的作用及機制研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs）是成體干細胞中的一種，具有多項分化潛能和較強的自我更新能力，同時又因為其具有易于分離培養(yǎng)和取材方便等特點，因此可作為骨科疾病治療、修復受損骨以及組織工程中完美的再生細胞。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）具有能夠誘導MSCs向成骨分化的能力，其中BMP9是目前研究發(fā)現(xiàn)誘導成骨能力最強。Notch信

2、號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物等多種動物體內(nèi)，是一條保守的信號通路，在生物胚胎期以及出生后的整個發(fā)育過程中都發(fā)揮著重要調(diào)控作用。對多種細胞系的增殖、分化、凋亡、粘附以及表皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化都有一定調(diào)控作用。有研究證實，在MSCs成骨分化過程，Notch信號通路參與了調(diào)控作用。課題組前期研究證明，Notch信號通路能夠促進BMP9誘導MSCs向成骨分化，但具體機制尚未明確。DLL1是Notch信號通路的一種配體，目前有研究報道，在膠質(zhì)

3、瘤中，DLL1可能通過阻滯細胞分化來促進細胞增殖；但在黑色素瘤中，DLL1能夠調(diào)節(jié)胚胎動靜脈分化以及成體損傷后的血管再生與修復。但目前還沒有研究報道DLL1對成骨分化作用的具體影響與機制。
　　第一部分實驗主要研究目的：探究DLL1在BMP9誘導MSCs向成骨分化的作用；研究發(fā)現(xiàn)DLL1促進BMP9誘導的MSCs成骨分化；在這個過程中，DLL1明顯上調(diào)BMP9的受體ALK2表達，而BMP9其余受體并沒有明顯變化；同時，我們發(fā)現(xiàn)No

4、tch信號通路抑制劑DAPT和dnNotch1作用后都出現(xiàn)同樣的調(diào)節(jié)ALK2表達的現(xiàn)象。因此，我們在第二部分著重研究，Notch信號通路是否通過上調(diào)ALK2影響B(tài)MP9誘導MSCs的成骨分化。
　　第一部分DLL1在BMP9誘導MSCs成骨分化中的作用
　　目的：了解Notch配體Delta-like1(DLL1)在BMP9誘導的MSCs成骨分化的作用及可能機制。方法：采用重組腺病毒分別上調(diào)BMP9，及DLL1，采用細胞化學

5、染色分別檢測早期成骨指標堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和晚期成骨指標茜素紅染色，了解DLL1在體外對BMP9誘導的成骨分化的影響；同時，通過裸鼠異位成骨實驗，mcroCT和HE染色，分析DLL1在體內(nèi)對BMP9誘導成骨分化的作用。另一方面，qRT-PCR檢測BMP9受體的表達情況，Western檢測p-Smad1/5/9和熒光素報告酶檢測Smad結(jié)合元件（Smad-binding element，SBE）

6、活性，分別從胞膜、胞漿和胞核三個水平了解DLL1對BMP9信號通路的影響，以了解DLL1促進BMP9誘導成骨分化的可能機制。結(jié)果：DLL1處理組與對照組相比，前者在體外能明顯促進BMP9誘導的MSCs的ALP及鈣鹽沉積；在體內(nèi)亦能促進裸鼠皮下成骨；在這一過程中，DLL1處理后，BMP9的受體ALK2明顯上調(diào)；Smad1/5/8蛋白總量沒有改變，p-Smad1/5/9蛋白表達水平升高，而SBE活性也有升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論

7、：DLL1在體內(nèi)外都能夠促進BMP9誘導MSCs成骨能力；在細胞膜、細胞漿及細胞核三個水平，對BMP9-Smad經(jīng)典信號通路都有作用。
　　第二部分Notch信號通路通過上調(diào)ALK2促進BMP9誘導MSCs成骨分化
　　目的：了解Notch信號通路是否是通過上調(diào)BMP9受體ALK2促進BMP9誘導的MSCs成骨分化作用。
　　方法：分別采用重組腺病毒DLL1和BMP9上調(diào)Notch和BMP9，DAPT和重組腺病毒dnN

8、otch1下調(diào)Notch，重組腺病毒siALK1和2下調(diào)ALK1和ALK2。分組處理MSCs細胞后，RT-PCR/qRT-PCR檢測受體表達情況；細胞化學法檢測早晚期成骨指標；流式細胞術檢測細胞周期以及凋亡情況；Edu檢測細胞增殖。
　　結(jié)果：BMP9誘導成骨過程中，上調(diào)/下調(diào)Notch，能引起ALK2，而不是ALK1表達量的變化；DLL1能逆轉(zhuǎn)由于干擾ALK2導致的早晚期成骨分化指標的減弱，但對siALK1處理組沒有影響；流式細