DLL1在BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs）是成體干細(xì)胞中的一種，具有多項(xiàng)分化潛能和較強(qiáng)的自我更新能力，同時(shí)又因?yàn)槠渚哂幸子诜蛛x培養(yǎng)和取材方便等特點(diǎn)，因此可作為骨科疾病治療、修復(fù)受損骨以及組織工程中完美的再生細(xì)胞。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）具有能夠誘導(dǎo)MSCs向成骨分化的能力，其中BMP9是目前研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)成骨能力最強(qiáng)。Notch信

2、號(hào)通路廣泛存在于脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物等多種動(dòng)物體內(nèi)，是一條保守的信號(hào)通路，在生物胚胎期以及出生后的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都發(fā)揮著重要調(diào)控作用。對(duì)多種細(xì)胞系的增殖、分化、凋亡、粘附以及表皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化都有一定調(diào)控作用。有研究證實(shí)，在MSCs成骨分化過(guò)程，Notch信號(hào)通路參與了調(diào)控作用。課題組前期研究證明，Notch信號(hào)通路能夠促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSCs向成骨分化，但具體機(jī)制尚未明確。DLL1是Notch信號(hào)通路的一種配體，目前有研究報(bào)道，在膠質(zhì)

3、瘤中，DLL1可能通過(guò)阻滯細(xì)胞分化來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖；但在黑色素瘤中，DLL1能夠調(diào)節(jié)胚胎動(dòng)靜脈分化以及成體損傷后的血管再生與修復(fù)。但目前還沒(méi)有研究報(bào)道DLL1對(duì)成骨分化作用的具體影響與機(jī)制。
　　第一部分實(shí)驗(yàn)主要研究目的：探究DLL1在BMP9誘導(dǎo)MSCs向成骨分化的作用；研究發(fā)現(xiàn)DLL1促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化；在這個(gè)過(guò)程中，DLL1明顯上調(diào)BMP9的受體ALK2表達(dá)，而B(niǎo)MP9其余受體并沒(méi)有明顯變化；同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)No

4、tch信號(hào)通路抑制劑DAPT和dnNotch1作用后都出現(xiàn)同樣的調(diào)節(jié)ALK2表達(dá)的現(xiàn)象。因此，我們?cè)诘诙糠种匮芯?，Notch信號(hào)通路是否通過(guò)上調(diào)ALK2影響B(tài)MP9誘導(dǎo)MSCs的成骨分化。
　　第一部分DLL1在BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化中的作用
　　目的：了解Notch配體Delta-like1(DLL1)在BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化的作用及可能機(jī)制。方法：采用重組腺病毒分別上調(diào)BMP9，及DLL1，采用細(xì)胞化學(xué)

5、染色分別檢測(cè)早期成骨指標(biāo)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和晚期成骨指標(biāo)茜素紅染色，了解DLL1在體外對(duì)BMP9誘導(dǎo)的成骨分化的影響；同時(shí)，通過(guò)裸鼠異位成骨實(shí)驗(yàn)，mcroCT和HE染色，分析DLL1在體內(nèi)對(duì)BMP9誘導(dǎo)成骨分化的作用。另一方面，qRT-PCR檢測(cè)BMP9受體的表達(dá)情況，Western檢測(cè)p-Smad1/5/9和熒光素報(bào)告酶檢測(cè)Smad結(jié)合元件（Smad-binding element，SBE）

6、活性，分別從胞膜、胞漿和胞核三個(gè)水平了解DLL1對(duì)BMP9信號(hào)通路的影響，以了解DLL1促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)成骨分化的可能機(jī)制。結(jié)果：DLL1處理組與對(duì)照組相比，前者在體外能明顯促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的MSCs的ALP及鈣鹽沉積；在體內(nèi)亦能促進(jìn)裸鼠皮下成骨；在這一過(guò)程中，DLL1處理后，BMP9的受體ALK2明顯上調(diào)；Smad1/5/8蛋白總量沒(méi)有改變，p-Smad1/5/9蛋白表達(dá)水平升高，而SBE活性也有升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論

7、：DLL1在體內(nèi)外都能夠促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨能力；在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿及細(xì)胞核三個(gè)水平，對(duì)BMP9-Smad經(jīng)典信號(hào)通路都有作用。
　　第二部分Notch信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)ALK2促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化
　　目的：了解Notch信號(hào)通路是否是通過(guò)上調(diào)BMP9受體ALK2促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化作用。
　　方法：分別采用重組腺病毒DLL1和BMP9上調(diào)Notch和BMP9，DAPT和重組腺病毒dnN

8、otch1下調(diào)Notch，重組腺病毒siALK1和2下調(diào)ALK1和ALK2。分組處理MSCs細(xì)胞后，RT-PCR/qRT-PCR檢測(cè)受體表達(dá)情況；細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)早晚期成骨指標(biāo)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期以及凋亡情況；Edu檢測(cè)細(xì)胞增殖。
　　結(jié)果：BMP9誘導(dǎo)成骨過(guò)程中，上調(diào)/下調(diào)Notch，能引起ALK2，而不是ALK1表達(dá)量的變化；DLL1能逆轉(zhuǎn)由于干擾ALK2導(dǎo)致的早晚期成骨分化指標(biāo)的減弱，但對(duì)siALK1處理組沒(méi)有影響；流式細(xì)