哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路在吸煙誘導(dǎo)的氣道炎癥和慢性阻塞性肺疾病中的調(diào)控作用及機制研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種可以預(yù)防和治療的慢性氣道炎癥性疾病，疾病發(fā)展過程伴有不完全可逆的氣流受限，其病理學(xué)基礎(chǔ)是氣道對不同有害顆粒和氣體刺激引發(fā)的異常炎癥反應(yīng)。COPD的發(fā)病機制目前仍不明確，可能跟氣道炎癥，氧化應(yīng)激，蛋白酶/抗蛋白酶失衡，微生物病原體，自身免疫，細胞凋亡等有關(guān)。吸煙是COPD最主要的誘發(fā)因素之一，臨床研究結(jié)果顯示吸煙產(chǎn)生的活性氧分子

2、(reactive oxygen species，ROS)作用于肺泡巨噬細胞和表皮細胞，從而導(dǎo)致炎癥因子的大量表達和生長因子的釋放。動物實驗證實ROS還能誘導(dǎo)和促進表皮細胞的凋亡。
　　mTOR（Mechanistic Target of Rapamycin，mTOR）是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇3激酶(PI3K)相關(guān)的激酶家族。機體和細胞利用mTOR信號通路感受并整合各種外界因素如生長因子、應(yīng)激水平、能量水

3、平、氧氣濃度以及氨基酸水平等的影響，通過調(diào)控其下游各種信號途徑調(diào)節(jié)機體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯起始、脂質(zhì)體合成、能量代謝以及細胞自噬等生理過程，從而調(diào)節(jié)細胞的生長和代謝，并保持機體和細胞的穩(wěn)態(tài)平衡。其中最重要的一項功能是調(diào)控細胞自噬。自噬是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細胞內(nèi)需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome)，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細胞本身的代

4、謝需要和某些細胞器的更新。研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬可能通過介導(dǎo)吸煙誘導(dǎo)的氣道上皮細胞凋亡從而導(dǎo)致COPD的形成;細胞自噬相關(guān)基因LC3B的缺失抑制了吸煙誘導(dǎo)的COPD;而Egr-1和Cav-1等分子則可能通過其對細胞自噬和細胞凋亡的調(diào)控而影響吸煙誘導(dǎo)的COPD的形成。據(jù)此，我們提出本論文的關(guān)鍵科學(xué)問題:細胞自噬的上游信號mTOR是否也在吸煙誘導(dǎo)的氣道上皮細胞損傷和COPD形成過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用？如果可以，mTOR又是通過什么樣的分子機制調(diào)控

5、這一過程？
　　針對上述假設(shè)，體外研究擬利用香煙煙霧提取物(Cigarette Smoke Extract，CSE)處理人體氣道上皮細胞系以及檢測慢性阻塞性肺疾病患者和正常非吸煙者的肺組織標本。體內(nèi)研究擬構(gòu)建氣道上皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞mTOR特異性誘導(dǎo)敲除小鼠并給予香煙煙霧暴露，通過測定mTOR相關(guān)信號通路分子的表達、細胞自噬與凋亡、炎癥因子表達、氣道炎癥細胞浸潤、粘液分泌以及小鼠肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)等因素，闡明mTOR信

6、號通路在吸煙誘導(dǎo)的氣道炎癥和COPD分子發(fā)病機制中的關(guān)鍵調(diào)控作用，為有效預(yù)防和治療吸煙誘導(dǎo)的氣道炎癥提供新思路，為開發(fā)新型COPD防治藥物提供新靶點。
　　第一部分:AMPK/TSC2/mTOR信號通路在CSE誘導(dǎo)的人體氣道上皮細胞系炎癥和凋亡以及COPD患者肺組織中的調(diào)控作用及其機制研究
　　目的:證實CSE能誘導(dǎo)人體氣道上皮細胞系mTOR信號通路相關(guān)分子的磷酸化水平或者表達水平的改變;并通過應(yīng)用饑餓或siRNA干擾技術(shù)，

7、證明mTOR能調(diào)控CSE誘導(dǎo)的人體氣道上皮細胞炎癥因子釋放、自噬、壞死與凋亡。
　　方法:以3％低濃度CSE干預(yù)人體氣道上皮細胞系HBE，做不同的濃度和時間點處理，0、1、4、8、和24h后收集細胞。Western Blot和Q-PCR法檢測mTOR相關(guān)信號分子（AMPKa、TSC1、TSC2、mTOR、S6和LC3B）的磷酸化水平或者表達水平。Elisa和Q-PCR法檢測炎癥因子IL-6、IL-8的mRNA和蛋白質(zhì)水平。然后，以

8、較高濃度10％的CSE，干預(yù)人體氣道上皮細胞系HBE，做不同的濃度和時間點處理，0、1、4、8和12h后收集細胞。Western Blot法檢測細胞凋亡蛋白CleavedCaspase-3和Cleaved Caspase-9的表達，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。最后，利用HBSS溶液饑餓誘導(dǎo)、TSC2 siRNA和mTOR siRNA基因沉默以及給予藥物抑制劑等方法，研究AMPKα/TSC2/mTOR信號通路在CSE誘導(dǎo)人體氣道上皮細胞中炎

9、癥因子分泌、自噬與凋亡的水平。另外，Western Blot和免疫組化方法檢測慢性阻塞性肺疾病患者和正常非吸煙者肺組織mTOR和壞死蛋白RIP3的表達情況。
　　結(jié)果:與正常對照組相比，CSE組在人體氣道上皮細胞系HBE中誘導(dǎo)AMPK的磷酸化和TSC1/2的高表達，下調(diào)mTOR和p-S6的表達水平，誘導(dǎo)細胞自噬蛋白LC3B-Ⅱ表達增加。同時，炎癥因子IL-6和IL-8表達水平以及粘蛋白Muc5ac表達也明顯增加。凋亡蛋白cleav

10、ed caspase-3和cleaved-caspase-9表達增加。沉默TSC2基因或應(yīng)用自噬抑制劑氯喹和巴佛洛霉素A1下調(diào)CSE誘導(dǎo)的炎癥和凋亡。相反，應(yīng)用HBSS溶液饑餓誘導(dǎo)或沉默mTOR基因CSE誘導(dǎo)的炎癥和凋亡增加。通過對慢性阻塞性肺疾病患者和正常非吸煙者肺組織檢測，發(fā)現(xiàn)mTOR和p-S6蛋白表達水平有一定程度下降，相反，壞死蛋白RIP3表達水平增加。
　　結(jié)論:AMPKα-TSC2-mTOR信號通路調(diào)控CSE誘導(dǎo)人體氣

11、道上皮細胞中炎癥因子分泌，自噬、壞死與凋亡。沉默TSC2基因或應(yīng)用自噬抑制劑氯喹和可以保護CSE誘導(dǎo)的炎癥和凋亡。相反，饑餓或沉默mTOR基因惡化CSE誘導(dǎo)的炎癥和凋亡。
　　第二部分:mTOR信號通路在香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的小鼠慢性氣道炎癥和肺氣腫模型中的研究
　　目的:利用C57BL/6、氣道上皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞mTOR特異性誘導(dǎo)敲除的小鼠，從體內(nèi)證實mTOR信號通路在吸煙誘導(dǎo)的氣道炎癥和肺氣腫形成中的關(guān)鍵調(diào)控作用。<

12、br>　　方法:野生型的C57BL/6小鼠給予香煙煙霧分別暴露0、12周、24周，Western Blot、Q-PCR和免疫組化檢測mTOR相關(guān)信號分子的磷酸化水平或者表達水平、炎癥表達水平和肺氣腫情況。利用mTORflox/flox小鼠，分別和氣道上皮細胞(CC10-rtTA/(tetO)7-Cre-）、肺泡Ⅱ型上皮細胞(SP-C-rtTA/(tetO)7-Cre-）的工具小鼠合籠，構(gòu)建氣道上皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞mTOR特異性誘導(dǎo)

13、敲除的小鼠品系，并給與口服強力霉素誘導(dǎo)mTOR基因敲除。上述兩種mTOR誘導(dǎo)敲除的小鼠以及其同窩對照組小鼠隨機分成吸煙組和空氣對照組，香煙煙霧暴露(0、4周、8周、12周、24周)，構(gòu)建慢性氣道炎癥和肺氣腫模型。Q-PCR和ELISA法檢測氣道炎癥因子IL-6和IL-8的分泌。Western blot和免疫組化方法檢測凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9、壞死蛋白RIP3以及mTOR相關(guān)信號分子

14、（TSC2、mTOR、S6和LC3B）的磷酸化水平或者表達水平。
　　結(jié)果:香煙煙霧暴露24周后，野生型小鼠肺組織mTOR和p-S6水平顯著下降，而TSC2蛋白表達水平增高。另外，與香煙煙霧暴露10周后的mTOR未誘導(dǎo)敲除小鼠相比，Western Blot和免疫組化結(jié)果顯示氣道上皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞mTOR特異性誘導(dǎo)敲除小鼠肺組織中，mTOR蛋白水平下降明顯。H&E染色結(jié)果顯示肺組織一定程度上出現(xiàn)異常，小鼠肺平均內(nèi)襯間隔(ML