粘蛋白Muc1在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、【研究背景】：
　　慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種以不可逆性氣流受限為特征的慢性炎癥性疾病，患病率和死亡率高。在我國(guó)的40歲以上人群中患病率高達(dá)8.2％(男性12.4%，女性5.1%)，嚴(yán)重危害公眾健康，給家庭和社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；WHO預(yù)測(cè)COPD將在2030年上升為第三大致死性疾病。因此，預(yù)防COPD并研究其發(fā)病原因、病理生理機(jī)制，找到有效的能夠干預(yù)其發(fā)生發(fā)展的方法及藥物就顯得尤為重要。
　　COPD的發(fā)病機(jī)制

2、目前仍未完全清楚，近年來普遍認(rèn)為慢性炎癥反應(yīng)是COPD發(fā)病機(jī)制的核心內(nèi)容，氧化應(yīng)激和抗氧化失衡、蛋白酶和抗蛋白酶失衡、自身免疫與細(xì)胞凋亡等多種因素共同參與了COPD的發(fā)病過程。目前已發(fā)現(xiàn)，吸煙是COPD發(fā)病的首要危險(xiǎn)因素，約80-90%以上的COPD患者是吸煙者。有研究表明，吸煙對(duì)人的免疫功能有廣泛的影響，吸煙能夠損害氣道上皮細(xì)胞的屏障功能，對(duì)人的先天性和后天性免疫功可均造成損害。長(zhǎng)期吸煙可導(dǎo)致肺部的慢性炎癥，主要表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞、中性粒

3、細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及CD8+T淋巴細(xì)胞[等炎性細(xì)胞的的增加,這些細(xì)胞能夠釋放炎性介質(zhì)和蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，從而在COPD的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　粘蛋白MUC1（人類用MUC1表示，動(dòng)物用Muc1表示）是一種主要由上皮細(xì)胞分泌的糖蛋白，主要分布在呼吸道、胃腸道、生殖道上皮細(xì)胞表面。就氣道而言，MUC1是氣道粘液最重要的組分之一，除了參與潤(rùn)滑上皮細(xì)胞和清除入侵的病原微生物外，有研究表明M

4、UC1還可以抑制肺部的急性炎癥反應(yīng)，缺失 Muc1基因的小鼠在感染后，肺內(nèi)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)、炎癥持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，說明 Muc1在肺組織急性感染過程中是重要的抗炎分子，對(duì)調(diào)節(jié)炎癥強(qiáng)度、促進(jìn)炎癥消退起重要作用。目前，關(guān)于MUC1在COPD病理生理過程中的功能及機(jī)制研究尚未見報(bào)導(dǎo)。
　　【研究目的】：
　　探討粘蛋白Muc1在COPD病理生理過程中的作用，并揭示其分子機(jī)制，為COPD的預(yù)防和治療提供新的分子靶點(diǎn)和思路。
　　【研究

5、方法】：
　　本研究首先采用熏吸香煙的方法建立小鼠的COPD模型，并對(duì)此模型進(jìn)行鑒定。采集COPD模型小鼠及其正常對(duì)照小鼠的肺泡灌洗液（BALF），血液，肺組織等，檢測(cè)BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量、分類及粘蛋白Muc5ac、細(xì)胞因子和炎性因子水平，并用熒光定量 PCR方法檢測(cè)肺組織 Muc1及炎性因子的 mRNA表達(dá)水平；應(yīng)用 HE染色、PAS染色及膠原三聯(lián)染色檢測(cè)肺氣腫、杯狀細(xì)胞及氣道重塑等方面的病變程度；檢測(cè)肺組織中與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（

6、EMT）相關(guān)的蛋白。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】：
　　一、用單純熏煙的方法成功建立了小鼠的COPD模型。
　　1、通過監(jiān)測(cè)各組小鼠在建立COPD模型過程的體重變化，發(fā)現(xiàn)兩組熏煙組小鼠在熏煙期間體重?zé)o明顯增加或增加緩慢，而正常對(duì)照組小鼠體重呈穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)，熏煙6個(gè)月后，兩組熏煙組小鼠體重均較其正常對(duì)照組小鼠明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Muc1-/-熏煙組小鼠體重與Muc1+/+熏煙組相比，體重減輕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、意義（P<0.05）。
　　2、用BUXCO小鼠肺功能儀檢測(cè)Muc1-/-和Muc1+/+熏煙組小鼠及其正常對(duì)照組小鼠肺功能。熏煙組FEV、FVC、TLC等指標(biāo)均較其正常對(duì)照組明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或P<0.01）；FEV100/FVC、Cdyn等指標(biāo)均較正常對(duì)照組明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或P<0.01）；Muc1-/-熏煙組FEV100/FVC等指標(biāo)較Muc1+/+熏煙組降低更為明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

8、（P<0.05）。
　　二、粘蛋白Muc1在COPD病理生理過程中的功能研究：
　　1、提取各組小鼠肺泡灌洗液（BALF），對(duì)BALF中白細(xì)胞進(jìn)行分類并計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)Muc1-/-和Muc1+/+COPD（熏煙組）模型組小鼠BALF總細(xì)胞數(shù)均高于其各自的對(duì)照組（P<0.01），但兩組COPD模型組之間無明顯差異；Muc1-/-COPD小鼠BALF中巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯低于Muc1+/+熏煙組小鼠（P<0.05）；兩組COPD小鼠BA

9、LF中性粒細(xì)胞數(shù)量均較其對(duì)照組明顯增加（P<0.05），但Muc1-/-COPD小鼠BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量多于Muc1+/+COPD小鼠（P<0.05）；兩組COPD小鼠BALF淋巴細(xì)胞數(shù)量均比其正常對(duì)照組明顯增加（P<0.05），兩組COPD模型組相比，Muc1-/-模型組BALF淋巴細(xì)胞明顯多于Muc1+/+模型組（P<0.05）。
　　2、用流式細(xì)胞的方法對(duì)各組小鼠BALF中的細(xì)胞及其亞型進(jìn)行進(jìn)一步分析：兩組COPD小鼠樹突

10、狀細(xì)胞（DCs）較其正常對(duì)照組明顯升高，差異具有顯著性（P<0.05）。兩組COPD小鼠相比，Muc1-/-COPD小鼠DCs明顯多于Muc1+/+COPD小鼠；兩組COPD小鼠BALF中B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞數(shù)量均較其正常對(duì)照組明顯增加（P<0.05），但都以T淋巴細(xì)胞占多數(shù)。各組小鼠T細(xì)胞中都以CD4+T淋巴細(xì)胞占多數(shù)；
　　3、對(duì)各組小鼠肺組織分別進(jìn)行HE染色、PAS染色和膠原三聯(lián)染色等發(fā)現(xiàn)，兩組COPD小鼠較其正常對(duì)照組小

11、鼠肺泡腔擴(kuò)大，肺泡結(jié)構(gòu)大小不一，部分肺泡間隔斷裂，肺泡融合，呈現(xiàn)出典型的肺氣腫病理改變；Muc1-/-COPD小鼠和Muc1+/+COPD小鼠相比，肺泡融合及肺泡腔擴(kuò)大更為明顯，肺泡腔平均直徑（Lm）明顯增加，P<0.05；PAS染色兩組COPD小鼠氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量較其對(duì)照組小鼠明顯增加，杯狀細(xì)胞主要分布于大氣道，中小氣道未發(fā)現(xiàn)。和Muc1+/+COPD小鼠相比，Muc1-/-COPD小鼠大氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異有顯著性（P<0

12、.05），表明Muc1-/-COPD小鼠氣道粘液分泌較野生型COPD小鼠更多；膠原三聯(lián)染色顯示，兩組COPD小鼠氣道壁膠原沉積分別較其正常對(duì)照組小鼠明顯增加，有顯著性差異，P<0.01，且主要分布于小氣道。兩組COPD小鼠相比發(fā)現(xiàn)，Muc1-/-COPD小鼠較Muc1+/+COPD小鼠小氣道膠原沉積更明顯，差異有顯著性（P<0.05）。
　　4、各組小鼠細(xì)胞因子、炎性因子及粘蛋白Muc5AC的檢測(cè)：
　　我們分別用ELISA

13、和FlowCytomix的方法檢測(cè)了各組小鼠BALF中的Muc5AC、TNF-a、KC、MIP-1a、MIP-2、MMP9、MMP12、IL-1a、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17、IL-18、IL21、IL-22、IL-27、IFN-γ和GM-CSF等。發(fā)現(xiàn)兩組COPD小鼠MIP-1a、MIP-2、MMP9、MMP12表達(dá)水平均較正常對(duì)照組明顯升高，差異有顯著性（P<0.05

14、）；兩組COPD小鼠IL-5、IL-10、IL12、IL-17、IL-27和IFN-γ表達(dá)水平均較正常對(duì)照組明顯降低，差異有顯著性（P<0.05）；Muc1-/-COPD小鼠IL-4和GM-CSF表達(dá)水平較其正常對(duì)照組明顯降，（P<0.05）；Muc1-/-COPD小鼠IL-6表達(dá)水平較其正常對(duì)照組明顯升高（P<0.05）；兩組COPD小鼠相比，Muc1-/-COPD小鼠KC、IL-6和MIP-a表達(dá)水平較Muc1+/+COPD小鼠明顯

15、升高，差異有顯著性（P<0.05），IL-17表達(dá)水平Muc1-/-COPD小鼠明顯低于Muc1+/+COPD小鼠；各組間IL-1a、IL-2、IL-22和TNF-a表達(dá)水平未見明顯差異。
　　兩COPD組小鼠BALF中粘蛋白Muc5AC的表達(dá)水平較其正常對(duì)照組明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或P<0.01），Muc1-/-COPD小鼠BALF中Muc5AC較Muc1+/+COPD升高更為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）

16、。
　　兩COPD組小鼠肺組織裂解液中NE的表達(dá)水平明顯高于其正常對(duì)照組，而Muc1-/-COPD小鼠NE的表達(dá)水平較Muc1+/+COPD升高更為明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　5、 RT-PCR檢測(cè)Muc1及多種炎性因子mRNA的表達(dá)水平。
　　檢測(cè)各組小鼠肺組織Muc1mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示Muc1+/+COPD小鼠Muc1 mRNA水平明顯高于野生型正常對(duì)照組，而Muc1-/-小鼠無論正常對(duì)照

17、組還是熏煙組，Muc1 mRNA無表達(dá)。Muc1+/+COPD小鼠IL-1a，IL-5，IL-6， IL-10，IL-12，IL-17和IL-21 mRNA水平較其正常對(duì)照組明顯升高；Muc1-/-COPD小鼠IL-6，IL-17和IL-21mRNA表達(dá)水平較其對(duì)照組明顯升高，IL-2則明顯降低，余白介素系列則無明顯變化；Muc1+/+COPD小鼠的TGF-β,GM-CSF,MIP-1a，MIP-2，MMP-9，MMP12，和TNF-a

18、均高于正常對(duì)照組；Muc1-/-COPD小鼠的MIP-1a，MIP-2，MMP-9，MMP12均高于正常對(duì)照組。Muc1-/-COPD小鼠的MIP-1a，TGF-β，IFN-γ和TNF-a均低于Muc1+/+COPD小鼠，以上比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　6、Western blot檢測(cè)Muc1、MMP9、MMP12、E-cadherin和Vimentin表達(dá)水平。
　　檢測(cè)各組小鼠肺組織與EMT相關(guān)的蛋白發(fā)現(xiàn)，

19、Muc1+/+COPD小鼠粘蛋白Muc1的表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高，而在Muc1-/-小鼠不表達(dá)；E-cadherin的表達(dá)在Muc1+/+COPD小鼠肺組織中明顯升高，在Muc1-/-小鼠中表達(dá)水平低于其正常對(duì)照組，差異有顯著性；MMP9的表達(dá)水平在兩組熏煙組中均明顯高于其正常對(duì)照組，但兩組熏煙組之間表達(dá)無差異；MMP12與Vimentin在兩組熏煙組中表達(dá)水平均明顯高于其正常對(duì)照組，且Muc1-/-COPD小鼠MMP12和Vim