哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2在白介素-35介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖抑制中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:1.闡明白介素-35(interleukin-35，IL-35)作為免疫調(diào)節(jié)因子，對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)的可能影響。2.探討哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2(mTORC2)在IL-35影響細(xì)胞增殖效應(yīng)中的作用。3.明確mTORC2在IL-35影響細(xì)胞增殖中的確切意義及作用機(jī)制，為探索膿毒癥免疫調(diào)控途徑提供新線索。
　　方法:以Jurkat細(xì)胞作為人T淋巴細(xì)胞模型。10％ FBS-RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至

2、1×105/ml，取1 ml/孔接種于12孔培養(yǎng)板，采用不同濃度IL-35(10、50、250 ng/ml)于不同時(shí)間點(diǎn)(12、24、48 h)予以刺激，刺激前6h予以PMA(50 ng/ml)和Ionomycin(1μM)輔助活化。實(shí)驗(yàn)一:采用IL-35刺激后，CCK法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，分析時(shí)間/劑量效應(yīng)關(guān)系;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，明確IL-35抑制T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的方式。實(shí)驗(yàn)二:采用Westernblot(WB)法及熒光共聚

3、焦法檢測(cè)隨IL-35刺激劑量的增加，mTORC2核心組分mTOR、Rictor蛋白表達(dá)及其下游信號(hào)通路蛋白SGK1、p27變化情況，籍以分析mTORC2在IL-35介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖抑制中的作用。實(shí)驗(yàn)三:應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法對(duì)mTORC2關(guān)鍵組分Rictor進(jìn)行調(diào)節(jié)，構(gòu)建細(xì)胞模型，進(jìn)而再次應(yīng)用CCK法對(duì)IL-35影響下的細(xì)胞增殖情況以及應(yīng)用WB法對(duì)mTOR、SGK1、p27蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，籍以分析mTORC2及其下游信號(hào)蛋白SGK

4、1、p27在IL-35介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖抑制中的關(guān)鍵作用與調(diào)控環(huán)節(jié)。
　　結(jié)果:1.當(dāng)IL-35劑量達(dá)到50 ng/ml和250 ng/ml、刺激12 h后，與對(duì)照組比較即呈現(xiàn)明顯的增殖抑制現(xiàn)象(P＜0.05）;而10 ng/ml組在刺激時(shí)間達(dá)24 h和48 h時(shí)，Jurkat細(xì)胞增殖活性也顯著下降（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在IL-35作用下，與對(duì)照組相比，更多的細(xì)胞停留在G0/G1期(50 ng/ml及250 ng/

5、ml組，P＜0.05)。2.WB結(jié)果顯示，單獨(dú)P/I活化的T淋巴細(xì)胞會(huì)引起mTOR、Rictor、SGK1、p27的磷酸化水平增加(P-mTOR Ser2481，P-Rictor Thr1135，P-SGK1Ser422，P-p27 T157; P＜0.05); IL-35作用下，隨劑量的增加，與活化對(duì)照組相比，各組蛋白磷酸化水平呈下降趨勢(shì)(P＜0.05)，而各組非磷酸化蛋白水平無(wú)明顯差異（P＞0.05）;共聚焦顯微鏡結(jié)果驗(yàn)證了上述變化

6、趨勢(shì)。3.設(shè)計(jì)Rictor Thr1135突變慢病毒，構(gòu)建細(xì)胞模型并采用WB驗(yàn)證Rictor表達(dá)良好后，檢測(cè)IL-35作用下模型細(xì)胞的增殖及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，干擾Rictor磷酸化位點(diǎn)以后，IL-35介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)顯著下降;同時(shí)mTORC2核心組分蛋白mTOR及其下游信號(hào)通路蛋白SGK1，p27其磷酸化水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:1.IL-35能夠以時(shí)間/劑量依賴特性對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，其效應(yīng)的