內(nèi)皮祖細(xì)胞在慢性阻塞性肺疾病中的變化和作用.pdf

1、目的：觀察慢性阻塞性肺疾病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的變化。
　　 方法：共收集2008年9月～2009年4月隨訪的穩(wěn)定期COPD患者20例，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2007年《慢性阻塞性肺疾病診治指南》，同時(shí)選擇20例非COPD者為對(duì)照，均無長期吸煙及被動(dòng)吸煙史，近2月無呼吸系統(tǒng)疾病史，經(jīng)病史詢問、體格檢查、胸部X線攝片、肺通氣功能測(cè)定均未發(fā)現(xiàn)肺部異常。密度梯度法分離外周血的單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)EPCs，并用添加了生長因子的特異

2、性內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖，以細(xì)胞呈“鋪路石”樣形態(tài)，結(jié)合FITC—UEA-I并攝取DiI-acLDL雙染色陽性，內(nèi)皮型一氧化氮合酶、血管性血友病因子表達(dá)陽性，鑒定為EPCs。通過計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)目測(cè)定EPCs的黏附能力，噻唑藍(lán)比色法測(cè)定EPCs的增殖能力，硝酸還原法測(cè)定EPCs分泌NO的能力，免疫印跡法測(cè)定EPCs的內(nèi)皮型一氧化氮合酶及磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：[1].外周血EPCs

3、量少，COPD組外周血分離的單個(gè)核細(xì)胞中EPCs比例低于對(duì)照組。[2].COPD病人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化后EPCs數(shù)量增加。[3].COPD組EPCs黏附數(shù)低于對(duì)照組。[4].COPD組EPCs eNOS、P-eNOS蛋白表達(dá)OD值均低于對(duì)照組。
　　 結(jié)論：[1].外周血來源的EPCs可以成功體外擴(kuò)增。[2].COPD病人外周血EPCs數(shù)量減少，黏附、增殖及分泌NO功能下降。[3].COPD病人eNOS表達(dá)下降。

4、r>　　 目的：經(jīng)氣管移植同種異體小鼠骨髓來源的EPCs，觀察EPCs在小鼠體內(nèi)的定位及移植的EPCs對(duì)COPD小鼠肺功能、氣道炎癥、肺泡和肺血管結(jié)構(gòu)改變及肺組織eNOS、P-eNOS蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：分離C57BL/6J小鼠骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞，予特異性內(nèi)皮培養(yǎng)基和細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化、培養(yǎng)，經(jīng)細(xì)胞“鋪路石”樣形態(tài)及結(jié)合FITC-UEA-I并攝取DiI-acLDL雙染色陽性、vWF表達(dá)陽性鑒定為EPCs。煙霧暴露法建

5、立COPD小鼠模型，小鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：對(duì)照組、COPD組、早期干預(yù)組、晚期干預(yù)組、PBS假干預(yù)組，每組8只，假干預(yù)組又隨機(jī)分為早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組，每組4只。COPD組小鼠放入自制熏煙箱中，每次予6支煙燃燒，15分鐘，每天4次煙霧暴露，共90天。對(duì)照組在箱中同樣時(shí)間，呼吸空氣。在煙霧暴露1個(gè)月、3個(gè)月時(shí)分別進(jìn)行早期、晚期干預(yù)，即CM-DiI標(biāo)記EPCs后，經(jīng)氣管途徑進(jìn)行同種異體EPCs移植。早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組在煙霧

6、暴露1個(gè)月、3個(gè)月時(shí)分別氣管內(nèi)注入PBS。停止煙霧暴露1月后收集標(biāo)本，小動(dòng)物肺功能儀測(cè)肺功能；肺病理切片蘇木素-伊紅(HE)染色后測(cè)定平均肺泡隔厚度(MAST)、平均內(nèi)襯間隔(MLI)和肺泡破壞指數(shù)(DI)評(píng)估肺氣腫程度；LOGENE-I病理圖像分析儀進(jìn)行肺血管形態(tài)學(xué)定量指標(biāo)觀察：測(cè)量與呼吸性細(xì)支氣管伴行的肺小動(dòng)脈外徑、管壁厚度、管腔面積和血管總面積，然后分別計(jì)算血管壁厚度與血管外徑比值(WT％)和管腔面積與血管總面積比值；支氣管肺泡灌

7、洗液(BALF)細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，Wright染色后細(xì)胞分類計(jì)數(shù)并計(jì)算比例；硝酸還原法測(cè)定BALF中NO含量；免疫印跡法測(cè)定肺組織內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(P—eNOS)的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：[1].小鼠骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞在添加了生長因子的特異性內(nèi)皮培養(yǎng)基中呈梭形、多邊形、鋪路石樣形態(tài)，結(jié)合FITC—UEA-I并攝取DiI-acLDL雙染色陽性，vWF表達(dá)陽性，鑒定為EPCs。[2].CM-Di

8、I標(biāo)記的EPCs經(jīng)氣管移植后在小鼠肺血管、氣道可見熒光表達(dá)。[3].經(jīng)煙霧暴露3個(gè)月，COPD組小鼠肺病理切片示肺氣腫改變。[4].在對(duì)照組、COPD組、早期干預(yù)組、晚期干預(yù)組、早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組平均肺泡隔厚度；平均內(nèi)襯間隔；破壞指數(shù)。CODP組MAST小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MAST在CODP組、早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；早期干預(yù)組MAST小于對(duì)照組，大于COPD組和早期假干預(yù)組，

9、差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；晚期干預(yù)組MAST小于對(duì)照組，大于COPD組和晚期假干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；早期干預(yù)組和晚期干預(yù)組MAST數(shù)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CODP組MLI、DI大于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；MLI、DI在CODP組、早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；早期干預(yù)組MLI、DI均大于對(duì)照組，小于COPD組和早期假干預(yù)組，

10、差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；晚期干預(yù)組MLI、DI均大于對(duì)照組，也均大于早期干預(yù)組，但小于COPD組和晚期假干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。[5].在對(duì)照組、COPD組、早期干預(yù)組、晚期干預(yù)組、早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組血管壁/血管外徑(WT％)分別為(7.96±2.66)％、(26.66±2.57)％、(13.10±2.07)％、(17.67±1.44)％、(26.45±2.14)％、(26.33±2.26)％

11、；管腔面積/血管面積(VA％)分別為(78.44±9.77)％、(54.88±4.80)％、(67.88±4.91)％、(63.66±7.89)％、(52.34±5.98)％、(53.46±5.04)％。COPD組WT％大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；WT％在COPD組、早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；早期干預(yù)組WT％大于對(duì)照組，但小于COPD組和早期假干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均

12、<0.05)；晚期干預(yù)組WT％大于對(duì)照組，也大于早期干預(yù)組，但小于COPD組和晚期假干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。COPD組VA％小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；VA％在COPD組、早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。早期干預(yù)組VA％小于對(duì)照組，但大于COPD組和早期假干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；晚期干預(yù)組VA％小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

13、，VA％在晚期干預(yù)組與COPD組之間及晚期干預(yù)組和晚期假干預(yù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。[6].Raw在COPD組、早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；早期干預(yù)組Raw低于COPD組和早期假干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；晚期干預(yù)組Raw高于對(duì)照組，也高于早期干預(yù)組，但低于COPD組和晚期假干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。COPD組CL低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CL在COPD組

14、、早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；早期干預(yù)組CL高于COPD組和早期假干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；晚期干預(yù)組CL低于對(duì)照組，也低于早期干預(yù)組，但高于COPD組和晚期假干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PEF在各組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[7].BALF中NO濃度在COPD組、早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；早期干預(yù)組BALF中NO濃度高于對(duì)照組，但低于COPD組和早期假干

15、預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；晚期干預(yù)組BALF中NO濃度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BALF中NO濃度在晚期干預(yù)組與COPD組之間及晚期干預(yù)組與晚期假干預(yù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[8].BALF細(xì)胞總數(shù)、AM、N、AM％、N％在COPD組、早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；早期干預(yù)組BALF細(xì)胞總數(shù)、AM、N高于對(duì)照組，但低于COPD組和早期假干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，N％高于對(duì)照組，與COPD組和早期假干預(yù)組比

16、較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；晚期干預(yù)組BALF細(xì)胞總數(shù)、AM、N高于對(duì)照組，也高于早期干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BALF細(xì)胞總數(shù)、AM、N、AM％、N％在晚期干預(yù)組與COPD組之間及晚期干預(yù)組與晚期假干預(yù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[9].在對(duì)照組、COPD組、早期干預(yù)組、晚期干預(yù)組、早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組肺組織eNOS、P-eNOS的蛋白表達(dá)OD值。COPD組肺組織eNOS、P-eNOS的蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肺組

17、織eNOS、P-eNOS的蛋白表達(dá)在COPD組、早期假干預(yù)組、晚期假干預(yù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；早期干預(yù)組肺組織eNOS、P-eNOS的蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，但高于COPD組和早期假干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；晚期干預(yù)組肺組織eNOS、P-eNOS的蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，但高于COPD組和晚期假干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肺組織eNOS、P-eNOS的蛋白表達(dá)在早期干預(yù)組和晚期干預(yù)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：[1]