哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在脂多糖調(diào)控的牙髓干細(xì)胞分化中作用的研究.pdf

1、牙髓炎是人類(lèi)口腔的常見(jiàn)病、多發(fā)病之一。目前的治療方法尚未能完全替代牙體組織的功能。組織工程的臨床應(yīng)用為恢復(fù)牙齒活性和功能帶來(lái)新的希望。特別是成功分離培養(yǎng)出具有自我更新和多向分化能力的牙髓干細(xì)胞(dentalpulpstemcells,DPSCs),因其可以形成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體,故是牙齒組織工程重要的種子細(xì)胞。在構(gòu)建組織工程牙齒過(guò)程中,除種子細(xì)胞和支架材料外,細(xì)胞所處的微環(huán)境、細(xì)胞間相互作用以及細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)分子的調(diào)控因素等都是影響細(xì)胞生長(zhǎng)

2、分化進(jìn)而影響組織工程實(shí)現(xiàn)的重要因素。
　　在牙髓炎性環(huán)境下,炎癥因子和致炎細(xì)菌成分均可影響DPSCs的生物學(xué)功能。Toll樣受體4(Toll-likeReceptor4,TLR4)作為細(xì)菌壁成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的特異性受體,在啟動(dòng)DPSCs的天然免疫及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,并且在牙髓炎發(fā)生時(shí),牙髓中革蘭陰性菌釋放的各類(lèi)毒性產(chǎn)物包括LPS的含量明顯增加。但目前關(guān)于LPS及其受體TLR4影響DP

3、SCs分化作用及機(jī)制的研究甚少。
　　哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)信號(hào)通路可以整合生長(zhǎng)因子、能量狀態(tài)等相關(guān)信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞自噬、生長(zhǎng)、免疫、炎癥、凋亡、蛋白合成與能量代謝等,是近年來(lái)各學(xué)科研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。目前關(guān)于mTOR在干細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用的研究已成為學(xué)者們關(guān)注的重點(diǎn),但是mTOR在細(xì)菌毒性炎性刺激的干細(xì)胞如LPS刺激的DPSCs中的生物學(xué)機(jī)制尚不明確。我們已

4、知牙髓組織炎癥是牙髓病中最主要的疾病,細(xì)菌是其重要的致病因素,因此闡明細(xì)菌成分脂多糖在DPSCs分化中的調(diào)控作用及其細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制具有重要的意義。本課題在體外分離、培養(yǎng)和鑒定人DPSCs的基礎(chǔ)上,通過(guò)LPS和mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素作用于DPSCs研究LPS活化的TLR4信號(hào)途徑調(diào)控的人DPSCs分化作用及mTOR對(duì)其的影響,以期闡明mTOR信號(hào)通路在LPS調(diào)控DPSCs分化中的分子機(jī)制,對(duì)闡明牙髓損傷修復(fù)時(shí)DPSCs分化的分子機(jī)

5、制有重要意義,為DPSCs組織工程應(yīng)用和將來(lái)臨床活髓保存治療提供新方法和新思路。
　　所取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1、脂多糖受體TLR4和mTOR在人DPSCs分化中的表達(dá)及變化
　　為獲得純化的人DPSCs,我們使用改良酶消化法分離獲得原代人牙髓細(xì)胞,利用有限稀釋法克隆培養(yǎng)并通過(guò)傳代純化細(xì)胞,結(jié)果顯示所培養(yǎng)的DPSCs形態(tài)典型、均一。采用流式細(xì)胞儀定量分析牙髓干細(xì)胞的Stro-1等表型的陽(yáng)性表達(dá)率,表明所獲細(xì)胞具

6、有間充質(zhì)干細(xì)胞屬性;將克隆鑒定的DPSCs分別進(jìn)行礦化誘導(dǎo)及成脂誘導(dǎo)14天,結(jié)果顯示茜素紅染色陽(yáng)性的礦化結(jié)節(jié)形成及油紅O染色陽(yáng)性的脂滴形成,表明DPSCs礦化誘導(dǎo)或成脂誘導(dǎo)后向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞或成脂樣細(xì)胞分化。以上結(jié)果表明:本研究克隆鑒定的DPSCs具有自我更新及多向分化的潛能,具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。從而再次表明DPSCs在牙齒組織工程領(lǐng)域有著廣闊的前景,也為本課題進(jìn)一步以DPSCs進(jìn)行的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　為探索DPSCs分化

7、過(guò)程中脂多糖受體TLR4和mTOR的表達(dá)情況,我們體外普通培養(yǎng)液培養(yǎng)上述克隆鑒定的DPSCs24h,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)結(jié)果顯示,DPSCs內(nèi)存在TLR4基因和mTOR基因的表達(dá);另外我們礦化誘導(dǎo)DPSCs7天、10天和14天,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timePCR)檢測(cè)DPSCs內(nèi)TLR4和mTOR的表達(dá)變化,結(jié)果表明在兩周內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)TLR4和mTOR的表達(dá)不斷增強(qiáng),提示TLR4和mTOR信號(hào)途徑可能

8、參與DPSCs的分化過(guò)程。
　　2、脂多糖對(duì)DPSCs分化過(guò)程中TLR4和mTOR表達(dá)的影響
　　為進(jìn)一步明確TLR4和mTOR是否參與脂多糖調(diào)控的DPSCs分化過(guò)程,我們將DPSCs在不同的誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)7天、10天和14天。分組情況如下:對(duì)照組加礦化誘導(dǎo)液,LPS刺激組為含終末濃度為1μg/mLLPS的礦化誘導(dǎo)液。Real-timePCR結(jié)果顯示LPS刺激組的TLR4mRNA和mTORmRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照,并且隨時(shí)間

9、延長(zhǎng)LPS刺激組的TLR4和mTOR表達(dá)均增高,以上結(jié)果提示TLR4和mTOR信號(hào)均可能參與脂多糖調(diào)控的DPSCs分化過(guò)程。
　　3、mTOR在脂多糖調(diào)控的DPSCs分化中的作用
　　為更好的理解脂多糖LPS對(duì)DPSCs調(diào)控的作用及mTOR在其中的作用機(jī)制,我們通過(guò)含各種刺激的礦化液分別誘導(dǎo)DPSCs7天、10天、14天,對(duì)照組加礦化誘導(dǎo)液,實(shí)驗(yàn)組LPS組加含終末濃度為1μg/mLLPS的礦化誘導(dǎo)液,實(shí)驗(yàn)組Rapa+LPS組

10、加含1μMRapa和1μg/mLLPS的礦化誘導(dǎo)液。通過(guò)ALP染色和茜素紅染色結(jié)果顯示,LPS組的ALP活性和礦化結(jié)節(jié)明顯高于對(duì)照,而Rapa+LPS組則明顯弱于LPS組。Real-timePCR結(jié)果顯示Rapa+LPS組的DSPP、BSP、OCN基因的表達(dá)明顯低于LPS組。而LPS組的DSPP表達(dá)明顯高于對(duì)照組;在10d、14d時(shí)LPS組的BSP基因表達(dá)也明顯高于對(duì)照;但是OCN基因的表達(dá)在7d時(shí)LPS組明顯高于對(duì)照組,在14d時(shí)LP

11、S組的OCN表達(dá)低于對(duì)照組。
　　同時(shí)我們通過(guò)含各種刺激的礦化液分別誘導(dǎo)DPSCs21天,掃描電鏡結(jié)果和茜素紅定量法結(jié)果顯示,LPS組能夠形成細(xì)胞外礦化基質(zhì)小球并且鈣含量明顯高于對(duì)照,但Rapa+LPS組顯示雷帕霉素抑制LPS誘導(dǎo)的礦化基質(zhì)小球形成和鈣含量。以上結(jié)果表明在一定時(shí)間內(nèi),一定濃度的LPS可以誘導(dǎo)DPSCs的分化能力,雷帕霉素則抑制LPS調(diào)控的分化作用,從而間接證實(shí)mTOR可能參與LPS調(diào)控的DPSCs分化作用。