PKC抑制劑白屈菜紅堿對蘇尼替尼所致心臟毒性的保護作用.pdf

1、蘇尼替尼（SUN）是一種新型小分子、多靶點的酪氨酸激酶抑制劑（TKI）類藥物，TKI類藥物選擇性抑制過度激活的酪氨酸激酶,主要用于腫瘤治療。與傳統(tǒng)的細胞毒類抗腫瘤藥物相比，此類藥物由于具有靶向性抗腫瘤特征在臨床凸顯優(yōu)勢，成為近年新藥研發(fā)的熱點。然而伴隨TKI類藥物的廣泛應用，其不良反應也逐漸顯露，其中最嚴重的不良反應就是其心臟毒性，表現為從無癥的心電圖改變，到左室射血分數（LVEF）降低，最終發(fā)展為充血性心力衰竭（CHF），嚴重威脅著患

2、者的生命健康。因此，探索該類藥物心臟毒性的分子機制、尋找特異性毒性防治藥物具有重要意義。酪氨酸激酶抑制劑所導致的心臟毒性的分子機制目前尚不清楚，可能與其抑制心肌細胞的多種酪氨酸激酶、進而抑制其中介的信號通路有關。基于蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）與CHF的密切關系，本課題組在前期的實驗中觀察了PKC抑制劑對TKI心肌細胞毒性的影響。結果發(fā)現在新生大鼠心肌細胞PKC抑制劑對伊馬替尼和蘇尼替尼（SUN）導致的細胞毒性

3、具有顯著保護作用，使用亞型選擇性PKC抑制劑發(fā)現這種保護作用來自對新型PKC（nPKC），而不是傳統(tǒng)型PKC（cPKC）的抑制，提示酪氨酸激酶抑制劑類藥物的心臟毒性可能與nPKC活性增高有關，抑制nPKC可能對TKI引發(fā)的心肌毒性具有保護作用。為驗證我們的上述設想，本實驗擬在整體動物水平觀察選擇性nPKC亞型抑制劑白屈菜紅堿（CHE）對 TKI類藥物蘇尼替尼導致的心臟毒性的影響，預期為探究酪氨酸激酶抑制劑心臟毒性的分子機制、尋找特異性防

4、治藥物提供實驗依據。
　　目的：整體動物水平給予SUN和不同劑量CHE，觀察CHE對SUN所致心臟毒性的影響；檢測心肌各PKC亞型表達量，探討CHE心肌保護的分子機制。
　　方法：健康成年雄性C57小鼠50只，隨機分為5組，每組10只。①組為正常對照（CON）組：按0.1 ml/10 g灌胃給予清水，同時按0.1ml/10g腹腔注射生理鹽水；②組為蘇尼替尼（SUN）組：按照200 mg/kg/d的劑量灌胃給予蘇尼替尼，同時0

5、.1 ml/10 g腹腔注射生理鹽水；③組為CHE低劑量治療組（SUN+CHE（L））：按照200 mg/kg/d的劑量灌胃給予蘇尼替尼，同時0.375 mg/kg/d劑量腹腔注射白屈菜紅堿；④組為CHE高劑量治療組（SUN+CHE（H））組：按照200 mg/kg/d的劑量灌胃給予蘇尼替尼，同時0.75 mg/kg/d劑量腹腔注射白屈菜紅堿；⑤組為陽性對照組（ SUN+OLM）：按照200 mg/kg/d的劑量灌胃給予蘇尼替尼，同時3

6、 mg/kg/d劑量灌胃給予奧美沙坦（OLM，常規(guī)心衰治療藥物）。給藥3周處理、取材，觀測以下指標：稱取心臟、肺的重量；取血，制備血清，檢測血清中肌鈣蛋白（cTnI）和腦鈉肽（BNP）濃度；取心臟組織，提取線粒體，檢測心肌細胞線粒體呼吸鏈復合物IV和V活性；取心臟組織做電鏡切片，觀察心肌細胞內線粒體等細胞器的結構及變化；取心臟組織做HE染色切片，觀察心肌細胞組織學形態(tài)及改變；取心臟組織，提蛋白做western，檢測各組心肌磷酸化PKC亞

7、型（p-PKCα、p-PKCε以及p-PKCδ）的表達情況。實驗數據均采用OriginPro7.5進行分析，采用均數±標準誤表示。運用單因素方差分析進行組間的數據比較，當P<0.05時，則認為組間的差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：⑴組織重量改變：給予SUN后小鼠肺組織、心臟的重量并未發(fā)生明顯改變，之后給予CHE和OLM也對小鼠肺和心臟重量無明顯影響。⑵血清酶學指標：單獨給予 SUN，小鼠血清 BNP水平與對照組相比顯著上升（P<0

8、.05），同時給予不同劑量的CHE和OLM后BNP水平均顯著下降（P<0.05），恢復至對照組水平；單獨給予SUN的小鼠血清cTnI水平顯著下降（P<0.01），同時給予不同劑量CHE和OLM后， cTnI水平均顯著上升（P<0.01），恢復至對照組水平。⑶線粒體功能指標：單獨給予SUN后，小鼠心肌細胞線粒體呼吸鏈復合物IV和V的活性均顯著下降（P<0.01），而在同時給予CHE和OLM后，這兩種復合物的活性均顯著升高（P<0.01），

9、并且給予了CHE的兩組明顯高于對照組水平。⑷組織結構學改變：透射電鏡結果顯示，在單獨給予SUN后，小鼠心肌細胞線粒體出現明顯的脊和膜融合現象，胞質輕度水腫；同時給予CHE和OLM后，線粒體脊和膜融合的現象明顯減輕，高劑量CHE處理動物的線粒體外觀完全恢復至正常。左心室心肌HE染色結果顯示，單獨給予SUN后，心肌細胞間質充血明顯，細胞核輕度增大；在同時給予了CHE和OLM后，間質充血明顯改善。⑸磷酸化PKC代表激活的PKC，本實驗采用We

10、stern檢測心肌磷酸化PKC亞型含量。結果顯示，與對照組相比，SUN組心肌磷酸化PKCε蛋白表達量顯著升高（P<0.05），而磷酸化PKCδ、PKCα表達量則無明顯變化；低劑量CHE和OLM對SUN所致的磷酸化PKCε過表達無明顯影響，高劑量的CHE顯著抑制了磷酸化PKCε的過表達（P<0.05），使其恢復至對照組水平。而CHE和OLM對磷酸化PKCδ、PKCα蛋白的表達無明顯影響。
　　結論：①CHE可以有效預防SUN導致的心