酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼與吉非替尼的肝臟毒性及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：考察小分子酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼與吉非替尼的肝臟毒性,研究?jī)烧叩母闻K毒性的作用機(jī)制,篩選尋找有效的肝臟保護(hù)劑,為兩藥的臨床合理運(yùn)用提供依據(jù)。
　　 方法：Sprague-Dawley大鼠灌胃給予Dasatinib,靜脈采血檢測(cè)血清AST、ALT和LDH值,肝組織勻漿,檢測(cè)谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)值,肝組織固定,切片HE染色做病理學(xué)檢查,評(píng)價(jià)Dasatinib的體內(nèi)肝臟毒性。培養(yǎng)大鼠原

2、代肝細(xì)胞,正常人肝細(xì)胞L02及Changliver研究Dasatinib對(duì)肝細(xì)胞的體外毒性機(jī)制。紫外吸收連續(xù)掃描檢測(cè)Dasatinib與GSH的測(cè)結(jié)合能力。MTTassay檢測(cè)不同濃度Dasatinib對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞,正常人肝細(xì)胞L02及Changliver作用48h的IC50值。DAPI染色,DNA凝膠電泳,PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,吖啶橙(AO)染色檢測(cè)自噬,H2DCFDA染色和JC-1染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢分別檢測(cè)活性氧

3、族(ROS)含量和線粒體膜電位(△ψm)的變化,westernblot法檢測(cè)Dasatinib誘導(dǎo)的凋亡、自噬以及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化。熒光定量PCR檢測(cè)HO-1和NQ01的mRNA水平。siRNA基因沉默技術(shù)沉默Atg5,JNK和p38的表達(dá),討論自噬和凋亡的關(guān)系,以及MAPK通路與自噬和凋亡的關(guān)系。荷人非小細(xì)胞肺癌A549裸鼠移植瘤模型評(píng)價(jià)Gefitinib的體內(nèi)抗腫瘤活性,同時(shí)眼眶采血檢測(cè)血清AST、ALT和LDH值,肝組

4、織切片。HE染色病理學(xué)檢查,評(píng)價(jià)Gefitinib的體內(nèi)肝臟毒性。L02及Changliver研究Gefitinib對(duì)肝細(xì)胞的體外毒性機(jī)制,MTTassay檢測(cè)IC50值,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS含量,AO染色檢測(cè)自噬,siRNA基因沉默技術(shù)沉默Atg5,討論自噬和凋亡的關(guān)系,westernblot法檢測(cè)Gefitinib誘導(dǎo)的凋亡、自噬以及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.Dasatinib在體內(nèi)可弓

5、l起Sprague-Dawley大鼠體重的減輕,血清肝轉(zhuǎn)氨酶AST、ALT和LDH的升高,肝組織內(nèi)GSH、SOD的降低和MDA的升高,損傷肝臟產(chǎn)生廣泛的空泡化,TUNEL染色檢測(cè)呈現(xiàn)陽性。
　　 2.Dasatinib在體外對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞,正常人肝細(xì)胞L02及Changliver有明顯的細(xì)胞毒性,作用48h后有較低的IC50值分別為21.1μM,12.5μM和15.5μM。
　　 3.DAPI染色顯示Dasatinib

6、作用肝細(xì)胞后,引起細(xì)胞核的固縮、碎裂,形成凋亡小體,DNA凝膠電泳表明,Dasatinib作用肝細(xì)胞后致使DNA形成180-200成倍堿基對(duì)的斷裂,形成典型的DNA梯狀條帶,westenblot結(jié)果顯示凋亡通路的效應(yīng)蛋白cleavedcaspase-3和PARP的切割片段都有相應(yīng)的表達(dá)改變,表明Dasatinib對(duì)肝細(xì)胞的損傷主要是通過細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。
　　 4.37℃GSH與Dasatinib共孵育5h,200-260nm紫外

7、吸收連續(xù)掃描顯示GSH的吸收峰和Dasatinib的吸收峰發(fā)生位移,表明Dasatinib能共價(jià)結(jié)合部分細(xì)胞內(nèi)重要的還原性物質(zhì)GSH。
　　 5.H2DCFDA染色顯示,Dasatinib能顯著升高肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平,降低細(xì)胞內(nèi)GSH的含量,形成氧化應(yīng)激,并激活MAPK通路,致使JNK,p38,ERK發(fā)生磷酸化,磷酸化蛋白呈現(xiàn)先增加后下降的變化趨勢(shì),N-乙酰半胱氨酸(NAC)作為典型的自由基清除劑能部分逆轉(zhuǎn)保護(hù)Dasatinib

8、引起的氧化應(yīng)激。與此同時(shí),氧化應(yīng)激的下游,兼有抗氧化應(yīng)激應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2被解離釋放出來,核轉(zhuǎn)位后促進(jìn)抗氧化基因HMOX-1和NQ01的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。
　　 6.JC-1染色顯示,Dasatinib作用后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的下降,線粒體腫脹實(shí)驗(yàn)顯示,Dasatinib30μM能引起線粒體開放性孔道的開放,釋放細(xì)胞色素c,級(jí)聯(lián)激活caspase通路,最終引起細(xì)胞的凋亡。
　　 7.Dasatinib弓I起

9、肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的同時(shí),還能誘導(dǎo)肝細(xì)胞的產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERstress),與之相關(guān)的通路上的關(guān)鍵蛋白p-eIF2α,p-PERK,ATF4和CHOP都有相應(yīng)的變化,ERstress可以級(jí)聯(lián)caspase的激活并導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡。
　　 8.通過對(duì)人源性肝細(xì)胞L02和Changliver的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Dasatinib產(chǎn)生氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的同時(shí),引起肝細(xì)胞發(fā)生自噬,并且這種自噬和凋亡是相互伴隨的,是一種保護(hù)性的自噬,預(yù)孵育3-

10、甲基腺嘌呤(3-MA)或沉默Atg5基因能夠減弱自噬而加重凋亡。
　　 9.Dasatinib激活的MAPK通路中,JNK與細(xì)胞的凋亡發(fā)生有關(guān),p38與細(xì)胞的自噬有關(guān)。沉默JNK基因,Dasatinib誘導(dǎo)的自噬不發(fā)生變化而凋亡增加;沉默p38基因,Dasatinib誘導(dǎo)的自噬減弱而凋亡增加。
　　 10.典型的抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)能減弱Dasatinib引起L02和Changliver肝細(xì)胞ROS水平的升

11、高。降低Dasatinib誘導(dǎo)的LC3,cleavedcaspase-3和PARP的表達(dá),減弱自噬和凋亡,保護(hù)Dasatinib誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性。
　　 11.Gefitinib200mg/kg能有效地抑制裸鼠荷非小細(xì)胞肺癌A549瘤的生長(zhǎng),在產(chǎn)生抑瘤藥效的同時(shí),發(fā)生了肝臟毒性,伴隨血清ALT、AST和LDH的升高和肝組織切片的病理學(xué)改變。
　　 12.Gefitinib作用L02和changliver肝細(xì)胞48h后的I

12、C50值分別為24.1μM和31.9μM.Gefitinib能弓I起L02和ChangliverROS的水平升高,激活MAPK通路,磷酸化激活的JNK,p38和ERK都呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)。
　　 13.Gefitinib在低濃度的情況下引起L02和Changliver的強(qiáng)烈自噬,在高濃度的情況下引起凋亡,自噬和凋亡呈現(xiàn)出先后的關(guān)聯(lián)順序,并且這種自噬也是保護(hù)性的。
　　 結(jié)論：酪氨酸激酶抑制劑Dasatinib與Gefiti