阿霉素與蘇尼替尼引起的心臟毒性及ZMY對其保護作用的機制研究.pdf

1、一.研究目的:(1)探討ZMY對阿霉素引起的大鼠原代心肌細胞毒性的保護作用、ZMY對阿霉素引起的小鼠心臟毒性的保護作用,以及ZMY對阿霉素心臟毒性保護作用的分子機制。(2)探討蘇尼替尼引起的大鼠H9c2心肌細胞毒性作用,并探索ZMY對蘇尼替尼引起的心肌細胞毒性的保護作用機制。
　　 二.研究方法:
　　 1.ZMY抗氧化活性及抗腫瘤活性作用研究:(1)DPPH法測定ZMY體外抗氧化活性研究;(2)MTT法測定ZMY與阿霉

2、素合用對K562、NB4、U937白血病細胞的協(xié)同抑制作用;(3)建立U937裸小鼠移植瘤模型評價ZMY與阿霉素合用的體內(nèi)抗腫瘤活性。
　　 2.ZMY對阿霉素引起的大鼠原代心肌細胞毒性的保護作用及其機制研究包括:(1)MTT法測定阿霉素及合用ZMY對大鼠原代心肌細胞的抑制作用;(2)全自動生化分析儀測定阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌細胞上清心肌酶譜的變化;(3)DCF法測定阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌細胞內(nèi)活性氧(ROS

3、)生成水平變化;(4)DAPI染色法檢測阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌細胞的凋亡情況;(5)JC-1法測定阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌細胞線粒體膜電位的變化;(6)Western-blot檢測阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌細胞內(nèi)凋亡蛋白的變化。
　　 3.ZMY對阿霉素引起的小鼠心臟毒性的保護作用研究:(1)建立ICR小鼠阿霉素心臟毒性模型,觀察合用ZMY后小鼠體重的變化;(2)觀察合用ZMY后小鼠存活率的變化;(3)觀

4、察合用ZMY后小鼠血清心肌酶譜的變化。
　　 4.蘇尼替尼引起的大鼠H9c2心肌細胞毒性作用及其機制研究包括:(1)MTI法測定蘇尼替尼對H9c2細胞的抑制作用,計算IC50值;(2)DAPI染色法檢測蘇尼替尼作用后H9c2細胞的凋亡情況;(3)AO染色法檢測蘇尼替尼作用后H9c2細胞內(nèi)酸性白噬泡生成情況;(4)轉染GFP-LC3質粒檢測蘇尼替尼作用后H9c2細胞內(nèi)自噬泡生成情況。(5)Western-blot檢測蘇尼替尼作用后

5、H9c2細胞內(nèi)凋亡蛋白和自噬蛋白的變化;(6)siRNA法沉默Beclin1基因的表達,抑制細胞自噬的水平,MTT法測定蘇尼替尼作用后細胞存活率的變化;
　　 5.ZMY對蘇尼替尼引起的大鼠H9c2心肌細胞毒性的保護作用及其機制研究包括:(1)MTT法測定蘇尼替尼及合用ZMY對H9c2細胞的抑制作用的變化;(2)DCF法測定蘇尼替尼及合用ZMY對H9c2細胞內(nèi)活性氧生成水平變化;(4)AO染色法檢測蘇尼替尼及合用ZMY后H9c2

6、細胞自噬情況的變化;(5)Western-blot檢測蘇尼替尼及合用ZMY后H9c2細胞內(nèi)自噬相關蛋白的變化。
　　 三.研究結果:
　　 1.ZMY具有很強的抗氧化活性并能協(xié)同增強阿霉素的體內(nèi)外抗腫瘤活性:(1)ZMY具有良好的DPPH自由基清除作用,其自由基清除能力超過維生素C;(2)ZMY與阿霉素合用對三種白血病細胞表現(xiàn)出較強的體外協(xié)同抑制作用;(3)在U937裸小鼠移植瘤模型中,給藥6天后,ADR2mg/kg、Z

7、MY500mg/kg和合用組腫瘤抑瘤率(％)分別為14.5、18.0和57.1,T/C(%)值分別為69.4、73.5和41.3.結果證實ADR2mg/kg和ZMY500mg/kg合用時可以顯著抑制U937腫瘤的生長,具有很好的協(xié)同抗腫瘤效果。
　　 2.ZMY通過其抗氧化活性對阿霉素引起的大鼠原代心肌細胞毒性的保護作用及機制:(1)ZMY對阿霉素引起的大鼠原代心肌細胞毒性作用表現(xiàn)出較強保護作用,阿霉素作用24h后阿霉素2μM單

8、用組和50μMZMY預處理組細胞抑制率分別為30.7%、14.5%;(2)心肌酶譜檢測結果顯示ZMY預處理組細胞比阿霉素單用組AST、LDH、CKMB值顯著下降;(3)作用3h后阿霉素2μM單用組ROS的生成為241.5%,50μMZMY預處理組細胞阿霉素作用3h后,ROS生成為80.0%,與阿霉素單用組相比ROS的水平顯著降低;(4)DAPI染色發(fā)現(xiàn),合用ZMY后阿霉素引起的大鼠原代心肌細胞的凋亡率隨之降低;(5)合用ZMY后可以逆轉

9、阿霉素引起的大鼠原代心肌細胞線粒體膜電位的降低;(6)Western-blot結果顯示,ZMY可以通過抑制ERK,進而抑制P53激活來減少阿霉素引起的心肌細胞凋亡,同時實驗結果表明ZMY還可以通過抑制JNK,P38激活,抑制凋亡.
　　 3.ZMY表現(xiàn)出很強的體內(nèi)心臟毒性的保護作用:(1)在ICR小鼠阿霉素心臟毒性模型中,合用ZMY后小鼠體重下降比阿霉素單用組明顯變慢;(2)阿霉素給藥6天后,500mg/kgZMY合用組ICR小

10、鼠存活率為84.62%,阿霉素單用組為7.69%,結果證實ZMY和阿霉素合用時可以顯著提高ICR小鼠存活率;(3)阿霉素單用組血清AST值為578±84IU/L,與合用ZMY500mg/kg組值276±102IU/L有顯著差異;阿霉素單用組LDH值為1603±303IU/L,與合用ZMY500mg/kg組值293±199IU/L有顯著差異;阿霉素單用組CKMB值為922±120IU/L,與合用ZMY500mg/kg組值248±270IU

11、/L有顯著差異。
　　 4.蘇尼替尼引起的大鼠H9c2心肌細胞毒性作用與細胞自噬有密切的關系:(1)蘇尼替尼對大鼠H9c2心肌細胞表現(xiàn)出較強的細胞毒性作用,作用48h后計算半數(shù)抑制濃度IC50值為6.53μM;(2)DAPI染色發(fā)現(xiàn),隨著蘇尼替尼給藥濃度的升高,H9c2細胞的死亡率隨之升高,但凋亡現(xiàn)象不明顯;(3)AO染色發(fā)現(xiàn),蘇尼替尼作用后H9c2細胞內(nèi)酸性自噬泡生成明顯增加;(4)通過轉染GFP-LC3質粒發(fā)現(xiàn),蘇尼替尼作用

12、后H9c2細胞內(nèi)自噬泡生成明顯增加;(5)Western-blot結果顯示,蘇尼替尼作用后H9c2細胞內(nèi)凋亡蛋白的表達沒有明顯的變化,但是細胞內(nèi)自噬蛋白LC3、Beclin1的表達與蘇尼替尼存在明顯的濃度依賴性和時間依賴性關系;(6)siRNA法沉默Beclin1后,抑制細胞自噬的水平,與相應對照組相比蘇尼替尼作用后細胞存活率明顯增加。
　　 5.ZMY對蘇尼替尼引起的大鼠H9c2心肌細胞毒性具有比較明顯的體外保護作用:(1)Z

13、MY對蘇尼替尼引起的H9c2細胞的抑制作用表現(xiàn)出明顯保護作用,作用24h后蘇尼替尼5μM單用組和50μMZMY預處理組細胞抑制率分別為28.3%、3.1%;(2)ROS檢測結果顯示,蘇尼替尼作用3h后,H9c2細胞內(nèi)活性氧生成明顯增加,呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性關系;合用ZMY后,與蘇尼替尼單用組相比ROS生成顯著降低;(3)AO染色發(fā)現(xiàn),合用ZMY后蘇尼替尼弓I起的H9c2細胞內(nèi)酸性自噬泡的生成明顯減少;(4)Western-blot結果