白屈菜紅堿對變形鏈球菌抑制作用的體外實驗研究.pdf

1、目的：齲病是人類最常見的口腔疾病，世界衛(wèi)生組織將其列為人類重點防治的疾病之一；變形鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)是人類最主要的致齲菌之一；白屈菜紅堿(Chelerythrine，CHE)是從中草藥白屈菜中提取的主要活性成份，但作用機制尚不太清楚。本文通過體外實驗研究CHE對S.mutans的生長、粘附以及代謝的影響，旨在探討其防齲作用機制，為今后開發(fā)出一種新型防齲制劑提供前期實驗依據(jù)。 材料

2、與方法: 1．CHE溶液和菌液制備： 采用二倍稀釋法將CHE對倍稀釋于腦心浸萃液瓊脂培養(yǎng)基(Brain HeartInfusion，BHI)中，配成100mg/ml至24.4μg/ml共計13個濃度的溶液。 將復(fù)蘇48h的菌種接種于BHI液體培養(yǎng)基中，厭氧條件下培養(yǎng)24h，然后離心，洗菌兩次，用無菌生理鹽水調(diào)光密度值(Optical Density,OD)為1.0的菌懸液，備用。 2．CHE溶液抑制S.

3、mutans生長的檢測 采用紙片擴散法測定不同濃度CHE溶液對S. mutans的抑菌圈大小，以1.6mg/ml的氯已啶作為陽性對照；采用試管稀釋法測定CHE對S.mutans生長的最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)大小。 3．CHE溶液對S.mutans產(chǎn)酸作用的影響 采用酸度計將已配制好的CHE溶液和對照組調(diào)定初始pH值為7.4，向低于MIC以下的CHE溶

4、液中接種S.mutans菌液，厭氧條件下分別培養(yǎng)3～48h，測定不同培養(yǎng)時間間隔上清液的pH值，并計算培養(yǎng)前后的◢pH。 4.CHE溶液對S.mutans疏水性的影響 取24.4μg/ml、48.81μg/ml、97.7μg/ml、195.3μg/ml、390.6μg/ml、781.3μg/ml 6個濃度組的CHE溶液，采用微生物粘著碳氫化合物法(Microbial adhesion tohydrocarbons，MAT

5、H)測定S.mutans細胞表面疏水性，計算細菌表面疏水率。 5.CHE溶液對S. mutans粘附作用的影響 取MIC以下的濃度，用BHI液體培養(yǎng)基配制48.81μg/ml、97.7μg/ml、195.3μg/ml、390.6μg/ml四個濃度組的CHE溶液。向0.05ml各濃度的CHE溶液分別加入已調(diào)定光密度為1.0的菌液0.1ml，BHI液體培養(yǎng)基2.1ml和50％蔗糖．0.5mol/l磷酸緩沖液0.25ml，于玻

6、璃試管中以與水平面呈30。的角度在厭氧條件下培養(yǎng)18h。然后將粘附到試管壁的細胞洗脫于蒸餾水中，測定540nm處的光密度值，并計算粘附抑制率。 6．葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransferase，GTF)的提取和細胞外水不溶性多糖(Waterinsoluble glucan，WIG)的檢測 用含2％蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基配制不同濃度的CHE溶液各3ml，加入S.mutans菌液0.3ml，厭氧培養(yǎng)24h，將細菌培

7、養(yǎng)物離心，收集上清液，以上試管各兩份，一份加入固體硫酸銨，使達60％飽和度，置于4℃冰箱過夜后離心，將沉淀溶于磷酸鹽緩沖液中透析48h，獲得GTF。采用考馬斯亮藍法(Bradford法)測定酶液總蛋白含量，采用蒽酮法測定酶．底物反應(yīng)液中還原糖量，GTF活性(IU)定義為標(biāo)準(zhǔn)條件下(37℃反應(yīng)lh)每min從蔗糖釋放1μmol還原糖所需的酶量，并計算GTF比活力大小。另一份加入0.5M NaOH洗滌、離心3次，合并上清液，加入3倍體積無水

8、乙醇，4℃冰箱過夜后離心，將沉淀加入0.1M NaOH溶液5ml溶解，采用葸酮法測定細胞外WIG的含量。 7．統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，各組總體均數(shù)之間比較采用單因素方差分析(Analysis of variance，ANOVA)；采用Student．Newman-Keuls檢驗進行各樣本組間均數(shù)的兩兩比較；相關(guān)分析采用Spearman檢驗方法。P<0.05為統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異，P<0.01為統(tǒng)計學(xué)上有

9、高度顯著性差異。 結(jié)果: 1．在紙片擴散法抑制S. mutans實驗中，6.25mg/ml至100 mg/ml的5組CHE溶液產(chǎn)生了抑菌圈，100 mg/ml CHE溶液產(chǎn)生的抑菌圈最大，為25.8mm。濃度與抑菌圈直徑之間呈正相關(guān)關(guān)系，經(jīng)Person相關(guān)分析，r=0.99，P<0.01。經(jīng)液體稀釋法實驗測定，CHE溶液對S. mutans的MIC為0.78 mg/ml。 2．隨著CHE溶液濃度逐漸降低，實驗前后

10、各溶液◢pH值則呈逐漸增高的趨勢，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，24.4μg/ml濃度組與對照組之間及390.6μg/ml與195.3μg/ml濃度組之間的◢pH值無顯著性差異(P>0,05)，其余各濃度組◢pH之間均有高度顯著性差異。 隨著培養(yǎng)時間間隔的延長，實驗前后各溶液◢pH值則呈逐漸增高的趨勢。3h間隔條件下，各濃度組與對照組◢pH之間無顯著性差異(P>0.05)，其余各時間間隔組間均有高度顯著性差異(P<0.01)。 CHE溶

11、液濃度越高則達到最大產(chǎn)酸抑制作用所需的時間越長。48.8μg/ml和97.7μg/ml CHE溶液與對照組的◢pH分別在6h和12h間隔的差異最大，而195.3μg/ml和390.6μg/ml濃度組與對照組的◢pH在24h間隔的差異最大。 3．隨著CHE溶液濃度的逐漸升高，疏水率呈逐漸降低的趨勢，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，各濃度實驗組與對照組之間均有高度顯著性差異(P<0.01)，24.4μg/ml、48.8μg/ml、97.7μg/ml和

12、195.3μg/ml四個濃度組間則均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。 4．隨著CHE溶液濃度的逐漸升高，粘附抑制率也隨之增高，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，195.3μg/ml和390.6μg/ml與對照組之間及與其余濃度組之間均有高度顯著性差異(P<0.01)；48.8μg/ml濃度組及97.7μg/ml濃度組與對照組之間則均無顯著性差異(P>0.05)。 5．隨著CHE溶液濃度的逐漸升高，S.mutans的GTF逐漸降低，各實驗組與對

13、照組均數(shù)之間均有高度顯著性差異(P<0.01)，但24.4μg/ml與48.8μg/ml兩個濃度組之間，97.7μg/ml、195.3μg/ml、390.6μg/ml三個濃度組之間無顯著性差異(P>0.05)。 隨著CHE溶液濃度的逐漸升高，各濃度組S.mutans產(chǎn)生的WIG逐漸降低，除了24.4μg/ml濃度組之外，各實驗組與對照組均有高度顯著性差異(P<0.01)，195.3μg/ml與390.6μg/ml之間無顯著性差異

14、(P>0.05)。 結(jié)論： 1．CHE對S.mutans的生長具有明顯的抑制作用，可顯著降低S.mutans的產(chǎn)酸作用； 2．CHE可以降低S.mutans細胞表面疏水性，并顯著抑制S.mutans在玻璃表面的粘附作用； 3．CHE對S.mutans菌液中葡萄基轉(zhuǎn)移酶具有一定抑制作用，降低了S.mutans細胞外WIG的合成； 4．在齲病防治領(lǐng)域，作為天然植物白屈菜的一種提取物，CHE具有一定應(yīng)用