利拉魯肽對體外誘導的非酒精性脂肪肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用.pdf

1、目的:通過觀察胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑利拉魯肽干預治療體外誘導的非酒精性脂肪肝細胞模型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)指標GRP78蛋白表達、ATF6核蛋白水平和caspase12的變化，探討利拉魯肽對NAFLD肝細胞抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激作用及細胞凋亡的機制。
　　方法:
　　1.體外誘導非酒精性脂肪肝細胞模型：體外用含10％胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人正常肝細胞L02細胞，加入油酸、棕櫚酸（2:1）誘導肝細胞脂肪變性

2、，建立非酒精性脂肪肝（NAFLD）細胞模型。
　　2.細胞分組及干預：1）正常對照組；2）NAFLD細胞模型組；3）NAFLD細胞模型+利拉魯肽+高脂培養(yǎng)液組：高脂培養(yǎng)液中加入濃度為10nmol/L利拉魯肽；4）NAFLD細胞模型+利拉魯肽+正常培養(yǎng)液組：正常培養(yǎng)液中加入濃度為10nmol/L利拉魯肽；5）正常細胞+利拉魯肽組：正常培養(yǎng)液中加入濃度為10nmol/L利拉魯肽；各組分別干預48h，收集樣品。檢測細胞內(nèi)脂肪含量與代謝水

3、平。
　　3.應用全自動生化儀檢測細胞內(nèi)甘油三酯（TG)的含量及上清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine Aminotransferase, ALT)，采用油紅“O”染色法測定細胞內(nèi)脂滴情況。
　　4.檢測氧化應激有關(guān)的指標MDA和SOD的水平。
　　5.采用qRT-PCR與Western blotting檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)指標GRP78蛋白表達以及下游ATF6核蛋白水平和細胞凋亡指標caspase12的變化。
　

4、　6.采用TUNNEL分析法檢測細胞凋亡的變化。
　　7.數(shù)據(jù)分析：所得數(shù)據(jù)采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示。實驗數(shù)據(jù)均進行正態(tài)分布檢驗及方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，不符合正態(tài)分布的采用K-W秩和檢驗。以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.利拉魯肽對正常L02細胞的TG、ALT水平、SOD活性、MDA含量、GRP78

5、、ATF6、caspase12mRNA和蛋白表達無明顯影響（P＞0.05）。
　　2.與正常對照組比較，NAFLD組細胞內(nèi)脂滴明顯增多，TG、ALT水平升高，SOD活性降低，MDA含量升高，GRP78、ATF6、caspase12 mRNA和蛋白表達均增高，凋亡指數(shù)增加，差異均有顯著性（P＜0.05）。
　　3.與NAFLD細胞模型組比較，NAFLD細胞模型+利拉魯肽治療+高脂培養(yǎng)液組、NAFLD細胞模型+利拉魯肽治療+正常

6、培養(yǎng)液組細胞內(nèi)脂滴明顯減少，TG、ALT水平下降，SOD活性升高，MDA含量降低，GRP78、ATF6、caspase12 mRNA和蛋白表達減少，凋亡指數(shù)下降，差異均有顯著性（P＜0.05）。
　　4.與NAFLD細胞模型+利拉魯肽治療+正常培養(yǎng)液組比較，NAFLD細細胞胞模型+利拉魯肽治療+高脂培養(yǎng)液組內(nèi)脂滴減少幅度較低，TG、ALT水平下降幅度減少，SOD活性上升幅度降低，MDA含量下降幅度減少，GRP78、ATF6、cas

7、pase12 mRNA和蛋白表達、細胞凋亡指數(shù)水平下降幅度較低，差異均有顯著性（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.高脂環(huán)境下，肝細胞凋亡的增加，而利拉魯肽可以對抗肝細胞凋亡。
　　2.GLP-1受體激動劑利拉魯肽可減輕肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，改善肝細胞功能。
　　3.GLP-1受體激動劑利拉魯肽可能通過下調(diào)GRP78、ATF6核蛋白的表達減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，維持細胞穩(wěn)態(tài)，進而使caspase-12的表達減少抑制肝細胞凋