飽和脂肪酸誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對肝細胞脂毒性凋亡的作用和機制探討.pdf

1、背景與目的:
　　非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種由遺傳-環(huán)境-代謝應激相關(guān)因素所致的以肝細胞內(nèi)脂肪堆積為主要表現(xiàn)的臨床病理綜合征。在我國，NAFLD的發(fā)病率日趨升高，并已成為嚴重威脅人民健康的主要疾病之一。NAFLD包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、脂肪性肝纖維化和肝硬化。單純性脂肪肝

2、進展緩慢，NASH時肝內(nèi)巨噬細胞、星狀細胞活化，導致肝內(nèi)炎癥、纖維化的發(fā)生發(fā)展，最終可進展為肝硬化、原發(fā)性肝癌等終末期肝病。最近研究發(fā)現(xiàn)，NASH患者并發(fā)心腦血管疾病的風險也明顯上升，如動脈粥樣硬化、腦梗死、心肌梗死等。因此，是否存在NASH是影響NAFLD患者預后的重要因素。至今，NASH的發(fā)病機制仍未完全闡明。血中游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs)濃度升高、肝細胞脂性病變及凋亡增加是NASH的重要特征。當循環(huán)中

3、FFAs水平升高超過肝臟的氧化和代謝能力時，脂質(zhì)在肝臟異位沉積、炎性因子釋放和凋亡信號啟動，同時肝細胞對炎性反應和各種損傷因素的敏感性增高，由此導致的肝細胞功能障礙或死亡稱為脂毒性;由此引起的肝細胞凋亡，稱為脂毒性凋亡。肝細胞脂毒性凋亡在NASH的發(fā)生進展中是重要的始動環(huán)節(jié)并且參與整個發(fā)病過程。
　　目前NASH與肝細胞脂毒性凋亡的機制尚不完全明了。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)功能復雜，主要與蛋白的加

4、工成熟、鈣離子儲存、脂質(zhì)代謝、類固醇激素的合成及細胞的解毒相關(guān)。肝細胞富含ER, ER也是維持肝細胞正常功能的重要細胞器，眾多肝臟致病因素均能破壞ER穩(wěn)態(tài)，從而導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)。ER stress包括未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)和非UPR兩種途徑。蛋白質(zhì)的不正確折疊和/或錯誤折疊引發(fā)的ER stress反應稱UP

5、R，在哺乳動物細胞中由3種ER感應蛋白介導，即需肌醇酶1(inositol-requiringprotein1，IRE1)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶（PKR-like ER kinase，PERK）和活化轉(zhuǎn)錄因6(activatingtranscription factor6，ATF6)3種跨膜蛋白。非UPR包括磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositide-3-OH kinase/protein

6、kinase B，PI3K/Akt）、絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated proteinkinases，MEK/ERK)、糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3,GSK-3）、細胞核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor，NF-κB)、Tol

7、l樣受體(Toll-like receptor，TLR)等。這些通路分別對ER stress介導的細胞凋亡、炎性反應以及免疫反應有重要影響。早期的ER stress在維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用，但是過度的ER stress則會引起細胞凋亡，造成細胞和組織的損害。雖然已經(jīng)有報道指出，ER stress與NASH肝細胞脂毒性凋亡密切相關(guān)，但是有關(guān)ER stress在脂毒性凋亡中的作用機制仍有待進一步闡明。因此，本課題運用飽和脂肪

8、酸軟脂酸鈉誘導人正常肝細胞株L02和肝癌細胞株HepG2建立肝細胞脂變模型，從ER stress UPR和非UPR入手，研究軟脂酸鈉對UPR(PERK、IRE1、ATF6)和非UPR（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）信號通路的影響以及UPR和非UPR信號途徑對肝細胞脂毒性凋亡的調(diào)控作用，進而揭示軟脂酸鈉對肝細胞脂毒性的作用機制，這不僅有助于闡明NASH的發(fā)病機制，也為NASH的治療奠定新的理論基礎(chǔ)。

9、
　　方法:
　　一、軟脂酸鈉誘導L02和HepG2細胞發(fā)生脂毒性凋亡
　　1.軟脂酸鈉誘導L02和HepG2細胞建立肝細胞脂變模型用不同濃度的軟脂酸鈉及不同時間點(12、24、48h)誘導L02和HepG2細胞，通過MTT方法檢測細胞活力，篩選出軟脂酸鈉最佳誘導濃度建模;通過甘油三酯測定、油紅O染色檢測細胞內(nèi)甘油三酯含量和脂質(zhì)沉積情況。
　　2.軟脂酸鈉誘導脂變L02和HepG2細胞凋亡通過Annexin V-

10、PE/7-AAD流式細胞術(shù)、Hoechst33258細胞凋亡熒光染色以及透射電子顯微鏡檢測脂變模型肝細胞的凋亡率、觀察凋亡細胞的形態(tài)變化。
　　二、UPR調(diào)節(jié)軟脂酸鈉誘導肝細胞脂毒性凋亡的作用和機制
　　1.軟脂酸鈉誘導L02和HepG2細胞后，ER stress標志分子表達及UPR信號通路的激活情況軟脂酸鈉誘導細胞0、12、24、48h，收集細胞，提取胞漿蛋白、核蛋白和總RNA，通過Western blot和RT-PCR方

11、法檢測GRP78、磷酸化PERK(p-PERK)、ATF4和CHOP蛋白以及未剪接型XBP-1(uXBP-1)和剪接型XBP-1（XBP-1s）mRNA的表達，比較各時間點上述蛋白和mRNA表達水平較0h的變化情況。
　　2.沉默PERK基因?qū)浿徕c誘導的PERK/ATF4/CHOP通路阻斷及脂變肝細胞凋亡的影響將沉默效果最佳的PERK shRNA質(zhì)粒和Control shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02和HepG2細胞24h，再予軟脂酸鈉

12、誘導細胞48h，收集細胞，提取胞漿蛋白和核蛋白，通過Western blot、Annexin V-PE/7-AAD流式細胞術(shù)方法，對比PERK shRNA+軟脂酸鈉組與Control shRNA+軟脂酸鈉組總PERK(t-PERK)、ATF4和CHOP蛋白表達水平及細胞凋亡率的變化。
　　三、GSK-3β(非UPR)調(diào)節(jié)軟脂酸鈉誘導肝細胞脂毒性凋亡的作用和可能機制
　　1.軟脂酸鈉誘導L02和HepG2細胞后，GSK-3β蛋

13、白的表達水平以及GSK-3β在脂變肝細胞凋亡中的作用軟脂酸鈉誘導細胞0、12、24、48h，收集細胞，提取胞漿蛋白，Western blot方法檢測磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β，Ser9磷酸化）、總 GSK-3β(t-GSK-3β)蛋白的表達，比較各時間點p-GSK-3β、t-GSK-3β蛋白的表達水平較0h的變化情況。
　　GSK-3β特異性抑制劑Lithium chloride與軟脂酸鈉共同誘導（抑制劑組）和軟脂酸鈉誘

14、導（模型組）培養(yǎng)細胞0、12、24、48h，收集細胞，通過Western blot、Annexin V-PE/7-AAD流式細胞術(shù)方法，對比相同時間點抑制劑組與模型組p-GSK-3β蛋白表達水平和細胞凋亡率的變化。
　　將沉默效果最佳的GSK-3β shRNA質(zhì)粒和Control shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02和HepG2細胞24h，再予軟脂酸鈉誘導細胞48h，收集細胞，提取胞漿蛋白和核蛋白，通過Western blot、Annexin

15、 V-PE/7-AAD流式細胞術(shù)方法，對比GSK-3β shRNA+軟脂酸鈉組與Control shRNA+軟脂酸鈉組t-GSK-3β蛋白表達水平及細胞凋亡率的變化。
　　2.抑制GSK-3β蛋白活性和沉默基因表達對軟脂酸鈉誘導的GSK-3β非UPR通路的影響GSK-3β特異性抑制劑Lithium chloride與軟脂酸鈉共同誘導（抑制劑組）和軟脂酸鈉誘導（模型組）培養(yǎng)細胞0、12、24、48h，收集細胞，Western blo

16、t方法、Caspase-3分光光度法分別檢測磷酸化JNK(p-JNK)、Bax蛋白表達和Caspase-3活性，對比同一時間點抑制劑組與模型組p-JNK、Bax表達水平和Caspase-3活性的變化。
　　將沉默效果最佳的GSK-3β shRNA質(zhì)粒和Control shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L02和HepG2細胞24h，再予軟脂酸鈉誘導細胞48h，收集細胞，提取胞漿蛋白和核蛋白，通過Western blot方法，對比GSK-3β shR

17、NA+軟脂酸鈉組與Control shRNA+軟脂酸鈉組p-JNK、Bax、GRP78、磷酸化IRE1(p-IRE1)、p-PERK蛋白表達水平及Caspase-3活性變化。
　　結(jié)果:
　　一、軟脂酸鈉誘導L02和HepG2細胞發(fā)生脂毒性凋亡
　　1.不同濃度(36、72、108、144、180μtmol/L)的軟脂酸鈉誘導L02和HepG2細胞12、24h，細胞存活率變化不明顯;當濃度超過72μmol/L誘導細胞4

18、8h，細胞存活率較對照組明顯降低，因此在后續(xù)實驗中選用接近48h的2/3的IC50濃度(108μmol/L)作為軟脂酸鈉最佳誘導濃度。
　　2.軟脂酸鈉誘導L02和HepG2細胞12h，細胞內(nèi)甘油三酯含量和脂質(zhì)沉積變化不明顯;誘導24、48h，細胞內(nèi)甘油三酯合成增加、脂質(zhì)明顯沉積。
　　3.軟脂酸鈉誘導L02和HepG2細胞24h，與對照組比較，細胞凋亡率無明顯變化;誘導細胞48h，凋亡率較對照組明顯增加(P＜0.05)、凋

19、亡細胞發(fā)生形態(tài)變化、凋亡小體形成。
　　二、UPR調(diào)節(jié)軟脂酸鈉誘導肝細胞脂毒性凋亡的作用和機制
　　1.軟脂酸鈉誘導L02和HepG2細胞0、12、24、48h，GRP78蛋白的表達量逐漸增加，與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.軟脂酸鈉誘導L02和HepG2細胞0、12、24、48h，p-PERK、ATF4、CHOP蛋白的表達量均逐漸增加，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);僅

20、HepG2細胞12h時uXBP-1 mRNA水平較(O)h(一)過性的升高，在HepG2其它時間點及L02細胞中uXBP-1 mRNA水平無明顯變化，并且在各時間點均未檢測到XBP-ls mRNA表達。
　　3.構(gòu)建的3組PERK shRNA質(zhì)粒中，PERK1 shRNA質(zhì)粒的沉默效果最佳。沉默L02和HepG2細胞PERK基因后，與Control shRNA+軟脂酸鈉組比較，PERK shRNA+軟脂酸鈉組t-PERK、ATF4

21、和CHOP蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.PERK基因沉默后，PERK shRNA+軟脂酸鈉組細胞凋亡率較ControlshRNA+軟脂酸鈉組降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　三、GSK-3β（非UPR）調(diào)節(jié)軟脂酸鈉誘導肝細胞脂毒性凋亡的作用和可能機制
　　1.隨著軟脂酸鈉誘導L02和HepG2細胞時間(0、12、24、48h)延長，p-GSK-3β表達逐漸減低，間接反應了GS

22、K-3β蛋白的活性逐漸增加，與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.與模型組比較，L02和HepG2細胞抑制劑組p-GSK-3β蛋白表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明Lithium chloride可以通過增加軟脂酸鈉誘導肝細胞中p-GSK-3β(Ser9)蛋白的表達從而抑制GSK-3β活性。抑制劑組肝細胞凋亡率較模型組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.構(gòu)建的3

23、組GSK-3β shRNA質(zhì)粒中，GSK-3β1 shRNA質(zhì)粒的沉默效果最佳。沉默L02和HepG2細胞GSK-3β基因后，與Control shRNA+軟脂酸鈉組比較，GSK-3β shRNA+軟脂酸鈉組細胞凋亡率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.隨著軟脂酸鈉誘導L02和HepG2細胞時間(0、12、24、48h)延長，p-JNK和Bax蛋白表達以及Caspase-3活性逐漸增加。抑制劑組 p-JNK、B

24、ax蛋白表達水平和Caspase-3活性均較模型組降低。沉默GSK-3β基因后，與Control shRNA+軟脂酸鈉組比較，GSK-3β shRNA+軟脂酸鈉組p-JNK、Bax蛋白表達水平和Caspase-3活性降低，以上差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.沉默L02和HepG2細胞GSK-3β基因后，Control shRNA+軟脂酸鈉組GRP78、p-IRE1和p-PERK蛋白表達較Control shRNA組

25、明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。然而，GSK-3β shRNA+軟脂酸鈉組與Control shRNA+軟脂酸鈉組比較，上述蛋白表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　一、飽和脂肪酸誘導L02和HepG2細胞發(fā)生脂毒性凋亡。
　　二、PERK/ATF4/CHOP是介導飽和脂肪酸誘導肝細胞脂毒性凋亡的主要UPR信號通路。
　　三、GSK-3β（非UPR）可能通過p-JNK/