脂肪酸體外通過(guò)誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制HBV復(fù)制及HBsAg分泌.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒（ hepatitis B virus, HBV）感染合并非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）越來(lái)越多見(jiàn)，然而脂肪性肝病對(duì)HBV復(fù)制和相關(guān)抗原分泌的影響及其機(jī)制目前不清楚。肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ endoplasmic reticulum stress, ER stress）是參與多種肝臟疾病中常見(jiàn)的病理生理過(guò)程。為了解脂肪性肝病對(duì)HBV DNA復(fù)制及HBsA

2、g分泌的影響，本研究通過(guò)建立慢性HBV感染合并脂肪性肝病細(xì)胞模型，初步探討脂肪酸對(duì)HBV復(fù)制的影響及其機(jī)制。
　　方法：以HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15細(xì)胞為研究對(duì)象，用硬脂酸（stearic acid, SA）、油酸（oleic acid, OA）誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，應(yīng)用MTS法檢測(cè)SA、OA對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響，應(yīng)用油紅O-蘇木精染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況，GPO-PAP法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（triglyce

3、ride, TG）含量，確定慢性HBV感染合并脂肪性肝病細(xì)胞模型的建立。應(yīng)用Western Blotting（WB）技術(shù)檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein78, GRP78）、真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor2α, eIF2α）、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶（PKR-like ER kinase, PERK）、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（sterol

4、 regulatory element binding protein1c, SREBP1c）的表達(dá)及磷酸化水平來(lái)判斷細(xì)胞ER stress；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)培養(yǎng)上清 HBV DNA載量、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA法）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg、HBeAg水平來(lái)判斷HBV復(fù)制水平。進(jìn)一步分別用4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid, PBA）及GRP78小干擾RNA(small in

5、terfering RNA, GRP78 siRNA)減輕ER stress及阻斷GRP78表達(dá)，觀察脂肪酸對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV復(fù)制的影響。
　　結(jié)果：
　　1、SA和OA誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞發(fā)生脂肪變性。100μM SA及0.2mM OA分別作用于HepG2.2.15細(xì)胞后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)脂滴增多增大，并出現(xiàn)融合現(xiàn)象；細(xì)胞內(nèi)TG的合成也顯著增加。成功構(gòu)建了慢性HBV感染合并脂肪性肝病細(xì)胞模型。<

6、br>　　2、SA和OA誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞ER stress。用50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA分別作用于HepG2.2.15細(xì)胞48h后，GRP78表達(dá)均顯著增加；100μM SA及0.2mM OA作用于HepG2.2.15細(xì)胞后，GRP78表達(dá)水平、PERK及eIF2α磷酸化水平、SREBP1c表達(dá)水平從24h至72h時(shí)間依賴性增加。以上結(jié)果證實(shí)SA及OA時(shí)間及濃度依賴性誘導(dǎo)

7、HepG2.2.15細(xì)胞ER stress。
　　3、SA和OA抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg分泌。50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA在48h濃度依賴性抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg分泌；200μM SA時(shí)顯著抑制HBeAg分泌；100μM SA和0.2mM OA分別作用于HepG2.2.15細(xì)胞24h至72h后，細(xì)胞外HBsAg分泌顯著降低，HBeAg分泌也有下降但無(wú)

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果證實(shí)SA及OA時(shí)間及濃度依賴性抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg分泌。
　　4、SA和OA抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制。50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA作用于HepG2.2.15細(xì)胞48h，細(xì)胞外HBV DNA水平濃度依賴性降低；100μM SA和0.2mM OA分別作用于HepG2.2.15細(xì)胞后，從24h至72h細(xì)胞外HBV DNA水平顯

9、著降低。以上結(jié)果證實(shí)SA及OA時(shí)間及濃度依賴性抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制。
　　5、脂肪酸體外通過(guò)誘導(dǎo)ER stress抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg分泌和HBV DNA復(fù)制。用PBA減輕SA和OA誘導(dǎo)的HepG2.2.15細(xì)胞ER stress后，HBsAg分泌及HBV DNA復(fù)制水平顯著增加。以上結(jié)果說(shuō)明脂肪酸通過(guò)誘導(dǎo) HepG2.2.15細(xì)胞 ER stress抑制HBV復(fù)制及HBsAg分泌。

10、r>　　6、GRP78 siRNA對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV復(fù)制的影響。首先發(fā)現(xiàn)GRP78 siRNA顯著抑制SA誘導(dǎo)的GRP78表達(dá)，但我們觀察到用GRP78 siRNA抑制GRP78表達(dá)后，SA對(duì)HBsAg分泌及HBV DNA的抑制作用并未減輕，說(shuō)明脂肪酸可能并不通過(guò)誘導(dǎo)GRP78表達(dá)抑制HBsAg的分泌和HBV DNA復(fù)制。
　　結(jié)論：脂肪酸體外通過(guò)誘導(dǎo)肝細(xì)胞ER stress抑制HBsAg分泌和HBV DNA復(fù)制，初