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文檔簡介
1、目的:乙型肝炎病毒( hepatitis B virus, HBV)感染合并非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease, NAFLD)越來越多見,然而脂肪性肝病對HBV復(fù)制和相關(guān)抗原分泌的影響及其機制目前不清楚。肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激( endoplasmic reticulum stress, ER stress)是參與多種肝臟疾病中常見的病理生理過程。為了解脂肪性肝病對HBV DNA復(fù)制及HBsA
2、g分泌的影響,本研究通過建立慢性HBV感染合并脂肪性肝病細胞模型,初步探討脂肪酸對HBV復(fù)制的影響及其機制。
方法:以HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2.2.15細胞為研究對象,用硬脂酸(stearic acid, SA)、油酸(oleic acid, OA)誘導(dǎo)細胞發(fā)生脂肪變性,應(yīng)用MTS法檢測SA、OA對細胞增殖活力的影響,應(yīng)用油紅O-蘇木精染色觀察細胞內(nèi)脂滴形成情況,GPO-PAP法檢測細胞內(nèi)甘油三酯(triglyce
3、ride, TG)含量,確定慢性HBV感染合并脂肪性肝病細胞模型的建立。應(yīng)用Western Blotting(WB)技術(shù)檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78, GRP78)、真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor2α, eIF2α)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶(PKR-like ER kinase, PERK)、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol
4、 regulatory element binding protein1c, SREBP1c)的表達及磷酸化水平來判斷細胞ER stress;應(yīng)用實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測培養(yǎng)上清 HBV DNA載量、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)檢測細胞培養(yǎng)上清HBsAg、HBeAg水平來判斷HBV復(fù)制水平。進一步分別用4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid, PBA)及GRP78小干擾RNA(small in
5、terfering RNA, GRP78 siRNA)減輕ER stress及阻斷GRP78表達,觀察脂肪酸對HepG2.2.15細胞HBV復(fù)制的影響。
結(jié)果:
1、SA和OA誘導(dǎo)HepG2.2.15細胞發(fā)生脂肪變性。100μM SA及0.2mM OA分別作用于HepG2.2.15細胞后,隨著時間的延長,細胞內(nèi)脂滴增多增大,并出現(xiàn)融合現(xiàn)象;細胞內(nèi)TG的合成也顯著增加。成功構(gòu)建了慢性HBV感染合并脂肪性肝病細胞模型。<
6、br> 2、SA和OA誘導(dǎo)HepG2.2.15細胞ER stress。用50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA分別作用于HepG2.2.15細胞48h后,GRP78表達均顯著增加;100μM SA及0.2mM OA作用于HepG2.2.15細胞后,GRP78表達水平、PERK及eIF2α磷酸化水平、SREBP1c表達水平從24h至72h時間依賴性增加。以上結(jié)果證實SA及OA時間及濃度依賴性誘導(dǎo)
7、HepG2.2.15細胞ER stress。
3、SA和OA抑制HepG2.2.15細胞HBsAg分泌。50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA在48h濃度依賴性抑制HepG2.2.15細胞HBsAg分泌;200μM SA時顯著抑制HBeAg分泌;100μM SA和0.2mM OA分別作用于HepG2.2.15細胞24h至72h后,細胞外HBsAg分泌顯著降低,HBeAg分泌也有下降但無
8、統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果證實SA及OA時間及濃度依賴性抑制HepG2.2.15細胞HBsAg分泌。
4、SA和OA抑制HepG2.2.15細胞HBV DNA復(fù)制。50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA作用于HepG2.2.15細胞48h,細胞外HBV DNA水平濃度依賴性降低;100μM SA和0.2mM OA分別作用于HepG2.2.15細胞后,從24h至72h細胞外HBV DNA水平顯
9、著降低。以上結(jié)果證實SA及OA時間及濃度依賴性抑制HepG2.2.15細胞HBV DNA復(fù)制。
5、脂肪酸體外通過誘導(dǎo)ER stress抑制HepG2.2.15細胞HBsAg分泌和HBV DNA復(fù)制。用PBA減輕SA和OA誘導(dǎo)的HepG2.2.15細胞ER stress后,HBsAg分泌及HBV DNA復(fù)制水平顯著增加。以上結(jié)果說明脂肪酸通過誘導(dǎo) HepG2.2.15細胞 ER stress抑制HBV復(fù)制及HBsAg分泌。
10、r> 6、GRP78 siRNA對HepG2.2.15細胞HBV復(fù)制的影響。首先發(fā)現(xiàn)GRP78 siRNA顯著抑制SA誘導(dǎo)的GRP78表達,但我們觀察到用GRP78 siRNA抑制GRP78表達后,SA對HBsAg分泌及HBV DNA的抑制作用并未減輕,說明脂肪酸可能并不通過誘導(dǎo)GRP78表達抑制HBsAg的分泌和HBV DNA復(fù)制。
結(jié)論:脂肪酸體外通過誘導(dǎo)肝細胞ER stress抑制HBsAg分泌和HBV DNA復(fù)制,初
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