利拉魯肽對糖尿病合并非酒精脂肪性肝病大鼠自噬與肝細(xì)胞脂肪變性作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　通過觀察利拉魯肽（Liraglutide）干預(yù)治療糖尿病(DM)合并非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）大鼠肝細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3ⅡmRNA及蛋白表達(dá)的變化，并光鏡下觀察肝細(xì)胞脂肪變性的變化，同時(shí)加用氯喹阻斷自噬體與溶酶體融合抑制自噬后比較上述指標(biāo)變化，探討自噬與肝臟脂質(zhì)沉積的關(guān)系及利拉魯肽通過調(diào)節(jié)自噬對肝細(xì)胞脂肪變性的影響。
　　方法：
　　1.DM合并NAFLD大鼠模型制備：44只4～5周齡，體重在l8

2、0g～200gWistar雄性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)l周，每籠6只。后將大鼠隨機(jī)分為A、B兩組，A組10只，喂以普通飼料13.4kJ/g，其中脂肪提供熱量占10.2％，蛋白質(zhì)占23.3%，碳水化合物占66.5%；B組34只，喂以高糖高脂飼料21.8kJ/g，其中脂肪提供熱量占56.0%，蛋白質(zhì)占7.0%，碳水化合物占37.0%。兩組大鼠均自由飲水，每日早晚各投食一次，室溫控制在18～22℃，相對濕度30%～70%。12周時(shí)剪尾采血，用快速血糖

3、儀測兩組大鼠空腹血糖（FBG），A組大鼠FBG4.4-4.9mmol/L，B組大鼠FBG5.3-5.9mmol/L。并予B組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）25mg/kg，A組大鼠注射以等體積的生理鹽水，72h后剪尾采血快速血糖儀測FBG≥7.8mmol/L視為糖尿病造模成功，其中A組大鼠血糖均在正常范圍，B組大鼠死亡1只，其余均成模。從B組大鼠中隨機(jī)取8只大鼠處死，取肝組織行HE染色，光鏡下觀察肝小葉內(nèi)﹥30%的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變，并以

4、大泡性脂肪變?yōu)橹髡叽_定為NAFLD造模成功，8只大鼠均成模。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組及檢測指標(biāo)：將A組大鼠設(shè)為正常糖耐量對照組（NGT組，n=10),將B組大鼠設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，并隨機(jī)分為三組：DM合并NAFLD組（DM/NAFLD組， n=9）；利拉魯肽干預(yù)組（LIR組，n=8），予皮下注射利拉魯肽，100ug/Kg，Bid；利拉魯肽+自噬抑制劑氯喹（Chloroquine，CQ）組（LIR+CQ組，n=8），予皮下注射射利拉魯肽，100u

5、g/Kg，Bid及氯喹，50mg/Kg，每三天一次，共干預(yù)4周。后以20%烏拉坦腹腔注射麻醉，開腹，取腹主動(dòng)脈血，離心，分離血清后放于4℃冰箱保存，待生化方法檢測甘油三酯（TG)、總膽固醇（TC)、高密度脂蛋白膽固醇（HDL）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，以反應(yīng)各組大鼠糖脂代謝及肝功能情況。取肝臟組織稱取肝濕重，計(jì)算肝指數(shù)，反應(yīng)各組大鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況；取內(nèi)臟脂肪，計(jì)算內(nèi)臟脂

6、肪相對含量（VF/W)，反應(yīng)大鼠腹部脂肪含量；另切取肝組織100mg錫箔紙包好放于凍存管，后投入液氮保存，待PCR法檢測自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3ⅡmRNA，反應(yīng)肝細(xì)胞自噬變化。在肝右葉距邊緣5mm處取1cm×1cm×0.5cm肝組織塊浸泡于10%甲醛溶液固定48小時(shí)后進(jìn)行石蠟包埋，備做病理切片，用于免疫組化法檢測自噬相關(guān)標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ蛋白及光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞脂肪變性。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：上述指標(biāo)均為計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?x

7、±s)表示，運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，4組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布及方差齊性，4組間兩兩比較素采用單因素方差分析（ANOVA），LSD檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠一般狀況：適應(yīng)性喂養(yǎng)期間，每只大鼠飲食量、體重?zé)o明顯差異，精神狀態(tài)良好，毛色光澤。開始造模期間，B組（高糖高脂喂養(yǎng)）大鼠較A組（普通飼料喂養(yǎng)）大鼠飲食量、體重均增加，B組大鼠體型肥胖、少動(dòng)。造模成功后，藥物干預(yù)期間，NG

8、T組大鼠飲食量較之前無變化，體重呈穩(wěn)定增長，精神狀態(tài)良好，毛色光澤；DM/NAFLD組大鼠較同期NGT組大鼠體重增加，少動(dòng)；LIR組大鼠較同期DM/NAFLD組大鼠飲食量、體重均下降，精神狀態(tài)良好；LIR+CQ組大鼠精神萎靡，體毛蓬松失去光澤，有脫毛現(xiàn)象，與同期DM/NAFLD組大鼠比較，飲食量、體重均下降，與同期LIR組大鼠比較，飲食量、體重?zé)o差別。
　　2.光鏡下各組大鼠肝臟脂質(zhì)沉積變化及相關(guān)指標(biāo)比較：光境下NGT組大鼠肝組織

9、結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，胞漿可見極少量小脂滴。DM/NAFLD組大鼠肝細(xì)胞腫大，由多角形變成圓球形，胞質(zhì)透亮，呈氣球樣變，胞漿內(nèi)可見大量大小不一的脂滴，胞核被推向一邊。LIR組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞內(nèi)僅見少量小脂滴。LIR+CQ組大鼠肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞明顯增大，胞漿內(nèi)布滿脂滴。與NGT組比較，DM/NAFLD組及LIR+CQ組大鼠肝濕重、肝指數(shù)、VF/W、脂肪變性肝細(xì)胞數(shù)/總肝細(xì)胞升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

10、P＜0.05），LIR組大鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與DM/NAFLD組比較，LIR組大鼠肝濕重、肝指數(shù)、VF/W、脂肪變性肝細(xì)胞數(shù)/總肝細(xì)胞下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LIR+CQ組肝濕重、肝指數(shù)、脂肪變性肝細(xì)胞數(shù)/總肝細(xì)胞升高，差異有統(tǒng)計(jì)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），VF/W差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LIR+CQ組較LIR組大鼠肝濕重、肝指數(shù)、VF/W、脂肪變性肝細(xì)胞數(shù)/總肝細(xì)胞升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜

11、0.05）。
　　3.各組大鼠肝細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)志物比較：與NGT組比較，DM/NAFLD組及LIR組大鼠LC3ⅡmRNA及蛋白表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LIR+CQ組大鼠LC3ⅡmRNA及蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與DM/NAFLD組比較，LIR組大鼠LC3ⅡmRNA及蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）， LIR+CQ組大鼠LC3ⅡmRNA及蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0

12、.05）。LIR+CQ組較LIR組大鼠，LC3ⅡmRNA及蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.各組大鼠生化指標(biāo)比較：與NGT組比較，DM/NAFLD組及LIR+CQ組大鼠FBG、TG、TC、LDL、ALT、AST升高，HDL下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）， LIR組大鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與DM/NAFLD組比較，LIR組大鼠TG、TC、LDL、ALT、AST下降，HDL升高，差異有統(tǒng)計(jì)

13、學(xué)意義（P＜0.05），LIR+CQ組大鼠FBG下降，TG、TC、LDL、ALT升高，HDL下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AST差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LIR+CQ組較LIR組大鼠FBG、TG、TC、LDL、ALT、AST升高，HDL下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.在DM合并NAFLD早期階段已存在自噬增強(qiáng)，用利拉魯肽干預(yù)后自噬進(jìn)一步增強(qiáng)。
　　2.利拉魯肽能通過增強(qiáng)自