淺低溫對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷GLT-1及凋亡表達(dá)的影響.pdf

1、目的：研究大鼠全腦缺血再灌注即刻開(kāi)始的頭部淺低溫對(duì)GLT-1及凋亡表達(dá)的影響，來(lái)進(jìn)一步探討淺低溫的腦保護(hù)機(jī)制，為低溫療法在臨床中應(yīng)用提供參考。
　　方法：健康雄性wistar大鼠258只，通過(guò)隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為6組，具體如下：1)對(duì)照組（cotrol組，n=6）:不做任何手術(shù)操作，直接斷頭取材。2)假手術(shù)組（sham組，n=42）：只做暴露雙側(cè)椎動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈假手術(shù)操作。3)凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈組（VOA組，n=42）:凝閉大鼠雙側(cè)椎動(dòng)

2、脈48小時(shí)后，暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈穿線，但不阻斷血流。4)常溫缺血再灌注組（NI/R組，n=42）：凝閉大鼠雙側(cè)椎動(dòng)脈48小時(shí)后，暴露并夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈8分鐘，然后恢復(fù)血流再通，期間保持海馬溫度及肛溫在37±0.5℃。5)低溫組缺血再灌注組（HI/R組，n=42）：凝閉大鼠雙側(cè)椎動(dòng)脈48小時(shí)后，暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈，并穿線備用。采用鼻咽腔降溫法待海馬溫度降至33±0.5℃后夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈8分鐘，然后恢復(fù)血流再通，維持頭部淺低溫（33±0.5℃

3、），肛溫維持在37±0.5℃，2小時(shí)后自然復(fù)溫。6)生理鹽水+低溫缺血再灌注組（NS+HI/R組，n=42）：凝閉大鼠雙側(cè)椎動(dòng)脈48小時(shí)后，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并穿線備用，缺血前30 min右側(cè)腦室注射生理鹽水20μL，采用鼻咽腔降溫法待海馬溫度降至33±0.5℃夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，8 min后恢復(fù)血流再灌注，維持頭部淺低溫（33±0.5℃），肛溫維持在37±0.5℃，2小時(shí)后自然復(fù)溫。7)DHK+低溫缺血再灌注組（DHK+HI/R組，n=

4、42）：凝閉大鼠雙側(cè)椎動(dòng)脈48小時(shí)后，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈并穿線，缺血前30min右側(cè)腦室注射 DHK（二經(jīng)卡因酸鹽，為GLT-1功能性拮抗劑）溶液20μL（200nmol），采用鼻咽腔降溫法使海馬溫度降至33±0.5℃夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，8min后恢復(fù)血流再灌注，維持頭部淺低溫（33±0.5℃），肛溫維持在37±0.5℃，2小時(shí)后自然負(fù)復(fù)溫。對(duì)照組大鼠不做任何處理，直接斷頭取材。其余各組大鼠于缺血再灌注即刻（0h)、8h、16h、1d、3d

5、、5d、7d斷頭取腦，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6只，1～5組大鼠取腦后沿正中線縱行切開(kāi)，左側(cè)腦組織用4％多聚甲醛固定制成5mm石蠟切片，通過(guò)硫堇染色觀察海馬病理學(xué)變化，記錄神經(jīng)元密度（ND）和病理學(xué)分級(jí)（HG）。通過(guò)免疫組化技術(shù)觀察GLT-1、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。右側(cè)腦組織快速分離海馬CA1區(qū),液氮速凍后凍存于-80℃冰箱，通過(guò)Western blot技術(shù)對(duì)GLT-1蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。6、7組斷頭后直接多聚甲醛固定用于硫堇

6、染色，觀察病理學(xué)變化。
　　結(jié)果：
　　1.硫堇染色后光鏡觀察病理結(jié)果
　　對(duì)照組大鼠海馬CAl區(qū)的神經(jīng)元排列整齊有序，ND為214±3．7,HG為0級(jí)。假手術(shù)組各時(shí)間亞組都沒(méi)有明顯神經(jīng)元損傷，與對(duì)照組相比， ND和HG無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05)。NI/R組大鼠7d時(shí)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元幾乎全部死亡，HG明顯升高，為Ⅲ級(jí)，ND（42±3.4）明顯降低。HI/R組在7d只有散在神經(jīng)元損傷，HG為0～Ⅰ級(jí)，低于NI/R組7

7、d亞組（P＜0.05)；ND（187±3.0）顯著高于NI/R組7d亞組（P＜0.05)。NS+HI/R組在7d時(shí)，海馬CA1區(qū)未見(jiàn)明顯神經(jīng)元損傷，HG0～Ⅰ級(jí)，ND為175±2.1。而DHK+HI/R組，7d時(shí)CA1區(qū)可見(jiàn)大量神經(jīng)元死亡，HG分級(jí)為Ⅱ～Ⅲ級(jí)，ND為63±2.6，與NS+HI/R組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05)。
　　2.海馬組織GLT-1蛋白表達(dá)水平的比較。
　　2.1 Western blot分析

8、r>　　對(duì)照組GLT-1表達(dá)較少。假手術(shù)組與對(duì)照組比差異不顯著（P＞0.05）。在VOA組大鼠中，在缺血即刻開(kāi)始大量表達(dá)，8h時(shí)達(dá)峰，16h減少，1d最少，5d再次增多，各時(shí)間亞組明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）。NI/R組0h時(shí)明顯增多并迅速達(dá)峰值，8h減少，5d時(shí)下降最為顯著，7d基本達(dá)到缺血前水平，除1d外各時(shí)間亞組均低于VOA組（P＜0.05）。HI/R在0h開(kāi)始表達(dá)，8h達(dá)峰，16h減少，5d最少，但仍有較高水平表達(dá)，在各時(shí)間

9、亞組均高于NI/R組（P＜0.05）。
　　2.2 GLT-1免疫組化
　　GLT-1陽(yáng)性免疫顆粒主要表達(dá)于海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞中，呈棕黃色。假手術(shù)組和對(duì)照組各時(shí)間均有少量GLT-1表達(dá)。VOA組在0h大量表達(dá)，8h達(dá)峰，16h減少，3d時(shí)再次增多，然后減少，各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）。NI/R組在0h開(kāi)始增多，8h達(dá)峰，16h～7d時(shí)明顯減少，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于VOA組（P＜0.05）。在HI/R組除0h

10、以外，其他各時(shí)間均高于NI/R組（P＜0.05）。
　　3.海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較。
　　3.1 Bax免疫組化
　　Bax陽(yáng)性區(qū)域呈棕黃色顆粒狀沉積，主要分布于神經(jīng)元細(xì)胞胞漿和突觸的起始部。在對(duì)照組和假手術(shù)組，每個(gè)時(shí)間亞組Bax表達(dá)極少。VOA組0h開(kāi)始少量表達(dá)，16h達(dá)峰，然后降低，各時(shí)間亞組均略高于VOA組（P＜0.05）。NI/R組0h就開(kāi)始大量表達(dá)，3d達(dá)峰，5d和7d時(shí)大量減少，與VOA

11、比較，除5d,7d外，其余各個(gè)時(shí)間亞組均增高（P＜0.05）。HI/R組0h開(kāi)始有少量表達(dá)，16h達(dá)峰，各時(shí)間亞組均顯著低于NI/R組（P＜0.05）。
　　3.2 Bcl-2免疫組化
　　Bcl-2陽(yáng)性區(qū)域呈棕黃色顆粒狀沉積，主要分布于神經(jīng)元胞漿和突觸。對(duì)照組和假手術(shù)組各個(gè)時(shí)間亞組Bcl-2表達(dá)很少，兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05)。VOA組在0h開(kāi)始表達(dá)，至1～3d達(dá)峰，隨后減少。NI/R組在0h開(kāi)始表達(dá)，1d達(dá)峰，