脂多糖預(yù)處理對心肌干細(xì)胞遷移的影響及其機制研究.pdf

1、傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為，成年哺乳動物的心臟是終末分化的組織，沒有自我更新的能力。而近年來越來越多的證據(jù)表明，在成年人類及其他動物的心臟中，存在干細(xì)胞表面標(biāo)志物（如C-Kit，MDR-1，Sca-1）陽性的心肌源性干細(xì)胞，即心肌干細(xì)胞(cardiac stem cells，CSCs)。研究報道，在心肌缺血等病理性心肌損傷后，心肌組織中CSCs增殖/遷移能力的改變是決定心肌功能是否恢復(fù)或恢復(fù)程度好壞的關(guān)鍵。炎癥是不同心血管疾病，比如心衰、冠心病、高

2、血壓等發(fā)生發(fā)展機制中一個重要的病理過程。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞外膜上主要的分子組分，也是引起膿毒癥休克的主要致病因素，可導(dǎo)致包括心功能損傷在內(nèi)的多器官功能障礙。然而，近來有研究表明， LPS預(yù)處理可縮小梗死面積，促進(jìn)缺血復(fù)灌心臟心功能的恢復(fù)?？梢?，炎性介質(zhì)在心肌損傷及修復(fù)中起著雙重作用，但目前其機制尚不清楚。我們推測可能與炎性介質(zhì)促進(jìn)或抑制CSCs的增殖/遷移有關(guān)。Wnt/β-cate

3、nin信號通路是一條在生物進(jìn)化中極為保守的通路，控制著細(xì)胞增殖、干細(xì)胞維持、以及細(xì)胞遷移等重要的生命過程。在小鼠急性肺損傷模型的研究上發(fā)現(xiàn)，激活Wnt/β-catenin通路可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向損傷肺組織遷移，從而對受損組織給予修復(fù)。β-catenin是否參與了LPS引起的CSCs增殖、遷移的改變還尚不清楚。
　　目的：
　　本研究目的是觀察不同濃度LPS對CSCs增殖和遷移的影響;探討β-catenin是否參與了其潛在機制

4、。同時，在大鼠缺血復(fù)灌心肌損傷模型上明確移植LPS預(yù)處理的CSCs是否可通過增強其增殖和/或遷移能力，對抗心肌缺血損傷。
　　方法：
　　從新生SD大鼠心臟中分離CSCs，用不同濃度LPS(0、0.01、0.1、1μg/ml)刺激后，用CCK-8法檢測細(xì)胞生存情況，Transwell小室法測定心肌干細(xì)胞體外遷移能力。結(jié)扎左冠脈前降支法建立成年大鼠心肌缺血模型。將LPS(0.01μg/ml)預(yù)處理24h后的CSCs注射入大鼠缺

5、血危險區(qū)邊緣，CFDA熒光標(biāo)記法觀察CSCs向危險區(qū)中心遷移情況，TTC染色法評價心肌梗死面積。Western blotting法檢測心肌干細(xì)胞Toll樣受體4（toll like receptor4，TLR4）、連接蛋白43(connexin43，CX43)、β-catenin、熱休克蛋白90(heat shock protein90，HSP90)的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　(1)與空白對照組相比，低、中濃度LPS（0.01

6、、0.1μg/ml）孵育CSCs1d、3d、7d后，細(xì)胞生存率無明顯改變。低濃度LPS（0.01μg/ml）處理CSCs24 h后，細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增多。雖然0.1μg/ml LPS作用于心肌干細(xì)胞也能促進(jìn)CSCs遷移，但是效果不如低濃度處理組明顯。高濃度LPS(1μg/ml)孵育CSCs1d、3d后，雖然細(xì)胞生存率無明顯改變，但第7d的細(xì)胞生存率與空白對照組相比，明顯下降。且高濃度LPS處理CSCs24小時后，細(xì)胞遷移數(shù)目明顯下降。<

7、br>　　(2)將低濃度LPS(0.01μg/ml)預(yù)處理過的CSCs（事先用CFDA熒光標(biāo)記）注射入缺血30 min/復(fù)灌120 min的大鼠心臟。免疫組化結(jié)果顯示，與未經(jīng)LPS預(yù)處理的CSCs相比，經(jīng)LPS預(yù)處理后CSCs缺血危險區(qū)中心遷移的數(shù)量明顯增多。同時，TTC染色結(jié)果顯示，移植了LPS預(yù)處理后的CSCs，可使缺血后心肌的梗死面積明顯縮小。
　　(3)體外培養(yǎng)的CSCs低濃度LPS刺激24h后，對CSCs的CX43、TL

8、R4、總β-catenin蛋白表達(dá)無明顯影響。但細(xì)胞內(nèi)活化β-catenin（即未磷酸化的β-catenin）和細(xì)胞核內(nèi)β-catenin水平卻明顯增高。β-catenin的抑制劑FH535可抑制低濃度LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移增加。
　　(4)與空白對照組相比，體外培養(yǎng)的CSCs用低濃度LPS（0.01μg/ml）刺激后可顯著提高其HSP90的表達(dá)。與單純低濃度LPS組相比，采用HSP90抑制劑17-AAG與LPS共同孵育心肌干細(xì)胞后