益氣活血中藥對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向缺血心肌遷移的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、急性心肌梗死（Acute myocardial infaction，AMI）等缺血性心臟病仍然嚴(yán)重威脅人類的生命健康，AMI后慢性心力衰竭患者的遠(yuǎn)期生存率低，預(yù)后差，傳統(tǒng)的治療手段均難以從根本上恢復(fù)心肌細(xì)胞數(shù)量，改善心臟舒張和收縮功能。干細(xì)胞移植為AMI的治療開(kāi)辟了一條嶄新的措施與方法，有望從根本上改善梗死后心臟功能，因此近年來(lái)備受關(guān)注。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）因?yàn)槠涮赜械男再|(zhì)，而成為干

2、細(xì)胞移植領(lǐng)域最具有潛力的候選細(xì)胞。然而，MSCs移植治療AMI的突出問(wèn)題是干細(xì)胞的植入問(wèn)題，即難以實(shí)現(xiàn)足量的MSCs到達(dá)病變部位并存活。許多學(xué)者也提出采取聯(lián)合基因或藥物的方法提高 MSCs的歸巢。中醫(yī)藥治療缺血性心臟病有一套完整的理論體系，應(yīng)用益氣活血中藥治療缺血性心臟病，臨床療效顯著，既往實(shí)驗(yàn)證明益氣活血中藥對(duì)MSCs移植治療急性心肌梗死具有協(xié)同作用，然而，中藥的協(xié)同作用是否與促進(jìn) MSCs向缺血心肌的趨化遷移有關(guān)？據(jù)此，我們展開(kāi)了以

3、下實(shí)驗(yàn)研究。
　　目的:
　　1.體外觀察益氣活血中藥單體對(duì)MSCs遷移的影響。
　　2.在體觀察益氣活血中藥復(fù)方對(duì)MSCs向缺血心肌趨化遷移的影響。
　　3.從趨化因子受體CXCR4表達(dá)水平的變化探討益氣活血中藥促進(jìn) MSCs遷移的作用機(jī)制。
　　4.從Notch信號(hào)通路探討益氣活血中藥促進(jìn)MSCs遷移的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)小鼠骨髓MSCs，從表面分子標(biāo)志及

4、分化能力兩方面對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。流式細(xì)胞儀檢測(cè)（FACS）MSCs表面分子標(biāo)志，并將MSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，采用茜素紅染色。
　　2.用不同濃度的中藥單體丹參酮ⅡA、黃芪甲苷作用于第3代骨髓MSCs72h，進(jìn)行CFSE染色，應(yīng)用FACS分析CFSE的熒光強(qiáng)度，進(jìn)行最佳藥物濃度的篩選。
　　3.用最佳藥物濃度的丹參酮ⅡA、黃芪甲苷及二者的聯(lián)合干預(yù)第3代骨髓MSCs72h后，采用transwell裝置，進(jìn)行MSCs對(duì)S

5、DF-1α的體外遷移實(shí)驗(yàn)。
　　4.對(duì)益氣活血中藥芪丹通脈片進(jìn)行拆方，SD大鼠隨機(jī)分為益氣組、活血組、復(fù)方組、對(duì)照組，灌胃給藥14d，之后建立大鼠急性心肌梗死模型，將經(jīng)Dio標(biāo)記的MSCs通過(guò)尾靜脈移植到大鼠體內(nèi)，移植3d后采用熒光顯微鏡觀察及FACS分析缺血心肌部位Dio陽(yáng)性細(xì)胞在各實(shí)驗(yàn)組的差別，4w后采用多導(dǎo)生理記錄儀比較各實(shí)驗(yàn)組心功能的改善狀況。以上內(nèi)容是益氣活血中藥促進(jìn)MSCs遷移的離體、在體功能實(shí)驗(yàn)。
　　5.以下

6、內(nèi)容是益氣活血中藥促進(jìn)MSCs遷移的機(jī)制研究。采用免疫熒光染色對(duì)MSCs的CXCR4表達(dá)與分布進(jìn)行觀察。用最佳藥物濃度的丹參酮ⅡA、黃芪甲苷及二者的聯(lián)合干預(yù)第3代骨髓MSCs72h后，采用FACS、real-timePCR、western blot的方法檢測(cè)各藥物干預(yù)組MSCs的CXCR4的表達(dá)差異。并用CXCR4的阻滯劑AMD3100干預(yù)各實(shí)驗(yàn)組后，進(jìn)行transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)。
　　6.用PCR瓊脂糖凝膠電泳的方法觀察分

7、析MSCs的Notch受體、配體表達(dá)。然后用RBP-J基因敲除小鼠來(lái)源的MSCs以阻斷Notch信號(hào)通路，采用FACS、real-time PCR、western blot的方法檢測(cè) RBP-J-/-組及RBP-J-/+組MSCs的CXCR4表達(dá)差異。
　　7.用最佳藥物濃度的黃芪甲苷、丹參酮ⅡA及二者的聯(lián)合干預(yù)第3代骨髓MSCs72h后，用real-time PCR方法檢測(cè)各藥物干預(yù)組Notch信號(hào)通路的下游靶基因HES1mRN

8、A，HES5 mRNA的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　　1. MSCs的表面抗原分子 CD34、CD45和MHCⅡ陰性，CD29、CD44、CD90、CD106和Sca-1均為陽(yáng)性。茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色呈陽(yáng)性，MSCs能夠定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，可證明其具有分化潛力。因此，獲得的細(xì)胞符合骨髓MSCs特征。
　　2. CFSE增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：丹參酮ⅡA濃度為0.2μg/mL時(shí)，MSCs增殖最快，與濃度為0.1μg/mL、0.

9、4μg/mL時(shí)比較，P<0.05，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；黃芪甲苷在濃度為0.4μg/mL時(shí)，MSCs增殖最快，與濃度為0.2μg/mL、0.8μg/mL時(shí)比較，P<0.05，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故丹參酮ⅡA，黃芪甲苷濃度分別為0.2μg/mL，0.4μg/mL時(shí)為藥物的最佳濃度。
　　3.最佳藥物濃度的丹參酮ⅡA、黃芪甲苷及其聯(lián)合組（T+A）作用于MSCs，進(jìn)行體外遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：對(duì)于MSCs遷移的影響，各組之間有明顯的差異

10、，P<0.05。T+A組較其余組遷移細(xì)胞數(shù)增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05，丹參酮ⅡA組較黃芪甲苷組遷移細(xì)胞數(shù)增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P<0.05，黃芪甲苷組較對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05。
　　4.成功建立了大鼠急性心肌梗死模型。MSCs移植后3d，運(yùn)用FACS分析或熒光顯微鏡下觀察Dio陽(yáng)性MSCs到達(dá)缺血心肌的數(shù)量，結(jié)果一致，各組間比較結(jié)果顯示：芪丹通脈片組Dio陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別高于益氣組、活血組與對(duì)照組，有顯著性

11、差異（P<0.05）；活血組 Dio陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于益氣組和對(duì)照組，有顯著性差異，（P<0.05）；益氣組Dio陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異，（P>0.05）。而各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌冰凍切片SDF-1α免疫熒光染色結(jié)果未見(jiàn)明顯差異。
　　5． MSCs移植后4w，采用多導(dǎo)生理記錄儀分析各實(shí)驗(yàn)組心功能改善情況，結(jié)果顯示：芪丹通脈片組 MAP、LVPSP、+LVdp／dtmax及-LVdp／dtmax均較對(duì)照組、益氣組、活血組

12、升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），對(duì)照組、益氣組、活血組之間比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。
　　6.激光共聚焦熒光顯微鏡觀察可見(jiàn) CXCR4在細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，且多數(shù)表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)。運(yùn)用FACS、real-time PCR、western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組MSCs上CXCR4的表達(dá)，結(jié)果均顯示：聯(lián)合用藥組MSCs的CXCR4表達(dá)優(yōu)于其余各組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；丹參酮ⅡA組優(yōu)于黃芪甲苷組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

13、P<0.05）。AMD3100阻斷CXCR4通路后，抑制了各組藥物對(duì)MSCs遷移的促進(jìn)作用。
　　7. PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明 MSCs有Notch受體和配體的表達(dá)。FACS、real-time PCR、western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：RBP-J-/-組MSCs的CXCR4的表達(dá)高于RBP-J-/+組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中藥單體干預(yù)MSCs后，檢測(cè)HES1mRNA及HES5mRNA的表達(dá)變化，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)

14、組HES5mRNA的表達(dá)量均很少，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HES1mRNA的表達(dá)各用藥組均較正常組減少，以 T+A聯(lián)合用藥組下降最明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。丹參酮ⅡA組較黃芪甲苷組下降明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.益氣活血中藥可以促進(jìn)MSCs向缺血心肌的趨化遷移，以復(fù)方作用最佳，活血藥作用優(yōu)于益氣藥。
　　2.中藥的作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制 MSCs的Notch信號(hào)通路以上調(diào)CXCR4的表