氧化應(yīng)激預(yù)處理對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的適應(yīng)性保護(hù)和促進(jìn)其遷移的機(jī)制研究.pdf

1、活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一類化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)活躍的氧的單電子還原產(chǎn)物，主要包括單線態(tài)氧，過氧化氫(H2O2)，超氧化物陰離子及羥自由基等活性分子，其中過H2O2是最重要的一種。機(jī)體ROS的產(chǎn)生增加和(或)清除ROS的能力降低時(shí)，ROS水平急劇升高可導(dǎo)致細(xì)胞顯著損傷，這種ROS積聚的狀態(tài)就是氧化應(yīng)激。一般來說，ROS通過細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，抑制蛋白質(zhì)功能，破壞核酸和染色體等方式損傷細(xì)胞。ROS也可作為關(guān)

2、鍵的細(xì)胞內(nèi)信號調(diào)節(jié)因子，參與對抗細(xì)胞損傷的存活機(jī)制，介導(dǎo)氧化應(yīng)激預(yù)處理的保護(hù)作用，參與細(xì)胞的增殖，遷移和分化。因此，對ROS在氧化應(yīng)激中的損傷與保護(hù)機(jī)制的深入研究，有利于改善損傷組織的微環(huán)境，有利于提高移植細(xì)胞的存活率，有利于提高細(xì)胞移植治療的效率。 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal stem cells，BMSCs)是一類存在于骨髓網(wǎng)狀間質(zhì)內(nèi)的非造血干細(xì)胞，可分化成各種類型的細(xì)胞，且具有擴(kuò)增快捷、取材方便

3、、無排異反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已被極大的關(guān)注。在治療以細(xì)胞損傷或丟失為特征的疾病具有較好的治療性作用，如在治療外傷性腦損傷、脊髓損傷、中風(fēng)和急性心肌梗死等疾病取得令人鼓舞的結(jié)果。 雖然BMSCs移植治療已取得一些進(jìn)展，但由于BMSCs在損傷區(qū)的存活率低，極大的限制了它的應(yīng)用，且凋亡被認(rèn)為是最主要的死亡方式。另外，靜脈注射移植的BMSCs必需到達(dá)細(xì)胞損傷或丟失處才能發(fā)揮其作用，遷移到達(dá)損傷處BMSCs的數(shù)量決定治療效果。SDF-1/CXCR

4、4軸在BMSCs遷移中起重要作用，同時(shí)也調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活和生長。本試驗(yàn)通過觀察不同濃度H2O2對BMSCs活性及遷移的影響，探討氧化應(yīng)激預(yù)處理對BMSCs的適應(yīng)性保護(hù)作用和促進(jìn)其遷移的機(jī)制，為BMSCs的移植治療提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。 一、氧化應(yīng)激預(yù)處理對BMSCs的適應(yīng)性保護(hù)作用 研究目的： 探討氧化應(yīng)激對BMSCs抗氧化應(yīng)激損傷的適應(yīng)性保護(hù)作用及機(jī)制 研究方法： 1.BMSCs表面抗原表達(dá)的測定

5、 2.MTT法檢測BMSCs活性 3.Hochest染色檢測BMSCs凋亡 4.流式細(xì)胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測BMSCs凋亡 5.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription—polymerase chain raction，RT—PCR)檢測Caspase—3、BCL—2 mRNA水平的變化 研究結(jié)果： 1.BMSCs的表型分析 BMSCs

6、表型為CD29，CD44陽性，而CD106、CD166、CD71、CD34為陰性；CD45的表達(dá)則不穩(wěn)定，部分標(biāo)本呈陽性，部分則呈陰性。 2.不同濃度H2O2作用24h對BMSCs凋亡的影響： 對照組的凋亡率為(2.25±0.26)：20，50μmol/L H2O2作用BMSCs24h組凋亡率分別為(2.29±0.51)％，(3.23±0.67)％，與對照組比較無明顯差異(P>0.01)。100、200、300、400、

7、500μmol/L H2O2作用BMSCs24h，凋亡率分別為(7.31±1.23)％，(12.93±1.57)％，(31.27±2.44)％，(44.17±3.16)％和(65.39±4.64)％，與對照組比較凋亡率明顯增加(P<0.01)。此結(jié)果表明：20、50μmol/L H2O2幾乎不引起B(yǎng)MSCs的凋亡；100-500μmol/L H2O2，且呈濃度依賴性引起B(yǎng)MSCs凋亡，其中500μmol/L H2O2引起50％以上的BM

8、SCs凋亡。 3.不同濃度H2O2預(yù)處理對BMSCs活性的影響 MTT活性檢測：20，50，100μmol/L H2O2預(yù)處理BMSCs24h活性分別為(277.62±5.21)％，(191.98±4.49)％，(66.53±3.37)％，20μmol/L H2O2預(yù)處理組與其他各組比較活性顯著增加(P＜0.05)。20μmol/L H2O2預(yù)處理BMSCs24h BMSCs活性明顯高于其他各組，因此我們選擇確定20μ

9、mol/L H2O2為預(yù)處理濃度。 4.H2O2預(yù)處理不同時(shí)間間隔對BMSCs活性的影響： MTT活性檢測：20μmol/L H2O2處理BMSCs24h后間隔6，12，24h，各組活性分別為(110.85±4.21)％，(187.38±7.49)％，(106.91±3.37)％。結(jié)果表明：20μmol/L H2O2處理BMSCs24h后間隔12h組細(xì)胞活性明顯高于其他各組(P＜0.05)，因此選擇預(yù)處理的時(shí)間間隔為1

10、2h。 5.H2O2預(yù)處理對BMSCs氧化應(yīng)激損傷的適應(yīng)性保護(hù)作用: 實(shí)驗(yàn)分為三組：A組：對照組，B組：20μmol/L H2O2預(yù)處理24h，恢復(fù)12h，500μmol/L H2O2刺激24h組，C組：500μmol/L H2O2處理24h組。 (1) Hochest熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察到，A組：BMSCs染色質(zhì)分布均勻，為彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光；B組：少量BMSCs的胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒

11、光；C組大量BMSCs的胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光。 (2) FCM定量檢測H2O2預(yù)處理對BMSCs的保護(hù)作用，結(jié)果表明：B組的凋亡率分別為，(25.32±1.49)％與C組(65.39±4.64)％比較顯著降低(P＜0.05)，說明20μmol/L的H2O2預(yù)處理能夠減少500μmol/L的H2O2誘導(dǎo)的凋亡。 (3) RT—PCR檢測Caspase—3、Bcl—2 mRNA水平的變化 A、B、C

12、三組，Bcl—2在mRNA水平上的相對表達(dá)量分別是0.501±0.021，0.778±0.024，0.385±0.028；Caspase—3在mRNA水平上的相對光密度比值分別是0.354±0.026，0.443±0.031，0.612±0.039。結(jié)果表明：B組Bcl—2mRNA表達(dá)明顯增加(與A、C組比較P＜0.05)，Caspase—3 mRNA表達(dá)明顯減少(與C組比較P＜0.05)；C組Bcl—2mRNA表達(dá)明顯減少，Caspa

13、se—3 mRNA表達(dá)明顯增加(與A、B組比較，P＜0.05)。 結(jié)論：低濃度H2O2不引起B(yǎng)MSCs的凋亡，且低濃度H2O2預(yù)處理對高濃度H2O2引起的BMSCs凋亡具有適應(yīng)性保護(hù)作用，其機(jī)制可能與H2O2預(yù)處理使BMSCs Bcl—2mRNA表達(dá)增加和Caspase—3mRNA表達(dá)降低有關(guān)。 二氧化應(yīng)激預(yù)處理增加骨髓間質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的作用機(jī)制 研究目的： 探討氧化應(yīng)激預(yù)處理對BMSCs遷移能力的影響

14、，闡明ERK信號通路在氧化應(yīng)激預(yù)處理上調(diào)BMSCs表面CXCR4的作用機(jī)制。 研究方法： 1 FCM定量分析BMSCs表面CXCR4蛋白的表達(dá)變化 2 RT—PCR、熒光定量PCR檢測CXCR4基因的表達(dá)變化 3 Western blot分析P—ERK1/2的變化 4遷移實(shí)驗(yàn)定量分析BMSCs遷移能力的變化 研究結(jié)果： 1.FCM分析結(jié)果表明20μmol/LH2O2處理BMSCs2

15、4h組CXCR4的表達(dá)率為(27.53±3.01)％與其他各組比較明顯增加(P<0.05)，說明H2O2預(yù)處理能明顯上調(diào)BMSCs表明CXCR4蛋白的表達(dá)。 2.熒光定量PCR結(jié)果表示20μmol/L H2O2處理BMSCs24h，CXCR4 mRNA的相對表達(dá)量為5.37±0.49，明顯高于其他各組(P<0.05)。 3.Western blot結(jié)果表明在H2O2處理BMSCs20分鐘時(shí)P—ERK1/2開始升高，持續(xù)至

16、40分鐘仍保持較高表達(dá)，60分鐘時(shí)開始衰減。 4.BMSCs遷移能力的變化 H2O2預(yù)處理后能明顯增加BMSCs向SDF-1的遷移能力，PD98059能阻斷H2O2預(yù)處理增加的BMSCs遷移能力，但LY29004并不影響B(tài)MSCs遷移能力。 5.抑制劑對BMSCs表面CXCR4表達(dá)的影響 流式細(xì)胞儀結(jié)果：H2O2預(yù)處理組和H2O2預(yù)處理+PD98059組BMSCs表面CXCR4表達(dá)率分別為(27.53±