氧化應激預處理對骨髓間充質干細胞的適應性保護和促進其遷移的機制研究.pdf

1、活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一類化學性質相當活躍的氧的單電子還原產物，主要包括單線態(tài)氧，過氧化氫(H2O2)，超氧化物陰離子及羥自由基等活性分子，其中過H2O2是最重要的一種。機體ROS的產生增加和(或)清除ROS的能力降低時，ROS水平急劇升高可導致細胞顯著損傷，這種ROS積聚的狀態(tài)就是氧化應激。一般來說，ROS通過細胞膜脂質過氧化，抑制蛋白質功能，破壞核酸和染色體等方式損傷細胞。ROS也可作為關

2、鍵的細胞內信號調節(jié)因子，參與對抗細胞損傷的存活機制，介導氧化應激預處理的保護作用，參與細胞的增殖，遷移和分化。因此，對ROS在氧化應激中的損傷與保護機制的深入研究，有利于改善損傷組織的微環(huán)境，有利于提高移植細胞的存活率，有利于提高細胞移植治療的效率。 骨髓間質干細胞(bone marrow stromal stem cells，BMSCs)是一類存在于骨髓網狀間質內的非造血干細胞，可分化成各種類型的細胞，且具有擴增快捷、取材方便

3、、無排異反應等優(yōu)點，已被極大的關注。在治療以細胞損傷或丟失為特征的疾病具有較好的治療性作用，如在治療外傷性腦損傷、脊髓損傷、中風和急性心肌梗死等疾病取得令人鼓舞的結果。 雖然BMSCs移植治療已取得一些進展，但由于BMSCs在損傷區(qū)的存活率低，極大的限制了它的應用，且凋亡被認為是最主要的死亡方式。另外，靜脈注射移植的BMSCs必需到達細胞損傷或丟失處才能發(fā)揮其作用，遷移到達損傷處BMSCs的數量決定治療效果。SDF-1/CXCR

4、4軸在BMSCs遷移中起重要作用，同時也調節(jié)細胞的存活和生長。本試驗通過觀察不同濃度H2O2對BMSCs活性及遷移的影響，探討氧化應激預處理對BMSCs的適應性保護作用和促進其遷移的機制，為BMSCs的移植治療提供實驗理論基礎。 一、氧化應激預處理對BMSCs的適應性保護作用 研究目的： 探討氧化應激對BMSCs抗氧化應激損傷的適應性保護作用及機制 研究方法： 1.BMSCs表面抗原表達的測定

5、 2.MTT法檢測BMSCs活性 3.Hochest染色檢測BMSCs凋亡 4.流式細胞儀(Flow cytometry，FCM)檢測BMSCs凋亡 5.逆轉錄聚合酶鏈反應(Reverse transcription—polymerase chain raction，RT—PCR)檢測Caspase—3、BCL—2 mRNA水平的變化 研究結果： 1.BMSCs的表型分析 BMSCs

6、表型為CD29，CD44陽性，而CD106、CD166、CD71、CD34為陰性；CD45的表達則不穩(wěn)定，部分標本呈陽性，部分則呈陰性。 2.不同濃度H2O2作用24h對BMSCs凋亡的影響： 對照組的凋亡率為(2.25±0.26)：20，50μmol/L H2O2作用BMSCs24h組凋亡率分別為(2.29±0.51)％，(3.23±0.67)％，與對照組比較無明顯差異(P>0.01)。100、200、300、400、

7、500μmol/L H2O2作用BMSCs24h，凋亡率分別為(7.31±1.23)％，(12.93±1.57)％，(31.27±2.44)％，(44.17±3.16)％和(65.39±4.64)％，與對照組比較凋亡率明顯增加(P<0.01)。此結果表明：20、50μmol/L H2O2幾乎不引起B(yǎng)MSCs的凋亡；100-500μmol/L H2O2，且呈濃度依賴性引起B(yǎng)MSCs凋亡，其中500μmol/L H2O2引起50％以上的BM

8、SCs凋亡。 3.不同濃度H2O2預處理對BMSCs活性的影響 MTT活性檢測：20，50，100μmol/L H2O2預處理BMSCs24h活性分別為(277.62±5.21)％，(191.98±4.49)％，(66.53±3.37)％，20μmol/L H2O2預處理組與其他各組比較活性顯著增加(P＜0.05)。20μmol/L H2O2預處理BMSCs24h BMSCs活性明顯高于其他各組，因此我們選擇確定20μ

9、mol/L H2O2為預處理濃度。 4.H2O2預處理不同時間間隔對BMSCs活性的影響： MTT活性檢測：20μmol/L H2O2處理BMSCs24h后間隔6，12，24h，各組活性分別為(110.85±4.21)％，(187.38±7.49)％，(106.91±3.37)％。結果表明：20μmol/L H2O2處理BMSCs24h后間隔12h組細胞活性明顯高于其他各組(P＜0.05)，因此選擇預處理的時間間隔為1

10、2h。 5.H2O2預處理對BMSCs氧化應激損傷的適應性保護作用: 實驗分為三組：A組：對照組，B組：20μmol/L H2O2預處理24h，恢復12h，500μmol/L H2O2刺激24h組，C組：500μmol/L H2O2處理24h組。 (1) Hochest熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察到，A組：BMSCs染色質分布均勻，為彌漫均勻的低強度熒光；B組：少量BMSCs的胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒

11、光；C組大量BMSCs的胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光。 (2) FCM定量檢測H2O2預處理對BMSCs的保護作用，結果表明：B組的凋亡率分別為，(25.32±1.49)％與C組(65.39±4.64)％比較顯著降低(P＜0.05)，說明20μmol/L的H2O2預處理能夠減少500μmol/L的H2O2誘導的凋亡。 (3) RT—PCR檢測Caspase—3、Bcl—2 mRNA水平的變化 A、B、C

12、三組，Bcl—2在mRNA水平上的相對表達量分別是0.501±0.021，0.778±0.024，0.385±0.028；Caspase—3在mRNA水平上的相對光密度比值分別是0.354±0.026，0.443±0.031，0.612±0.039。結果表明：B組Bcl—2mRNA表達明顯增加(與A、C組比較P＜0.05)，Caspase—3 mRNA表達明顯減少(與C組比較P＜0.05)；C組Bcl—2mRNA表達明顯減少，Caspa

13、se—3 mRNA表達明顯增加(與A、B組比較，P＜0.05)。 結論：低濃度H2O2不引起B(yǎng)MSCs的凋亡，且低濃度H2O2預處理對高濃度H2O2引起的BMSCs凋亡具有適應性保護作用，其機制可能與H2O2預處理使BMSCs Bcl—2mRNA表達增加和Caspase—3mRNA表達降低有關。 二氧化應激預處理增加骨髓間質干細胞遷移能力的作用機制 研究目的： 探討氧化應激預處理對BMSCs遷移能力的影響

14、，闡明ERK信號通路在氧化應激預處理上調BMSCs表面CXCR4的作用機制。 研究方法： 1 FCM定量分析BMSCs表面CXCR4蛋白的表達變化 2 RT—PCR、熒光定量PCR檢測CXCR4基因的表達變化 3 Western blot分析P—ERK1/2的變化 4遷移實驗定量分析BMSCs遷移能力的變化 研究結果： 1.FCM分析結果表明20μmol/LH2O2處理BMSCs2

15、4h組CXCR4的表達率為(27.53±3.01)％與其他各組比較明顯增加(P<0.05)，說明H2O2預處理能明顯上調BMSCs表明CXCR4蛋白的表達。 2.熒光定量PCR結果表示20μmol/L H2O2處理BMSCs24h，CXCR4 mRNA的相對表達量為5.37±0.49，明顯高于其他各組(P<0.05)。 3.Western blot結果表明在H2O2處理BMSCs20分鐘時P—ERK1/2開始升高，持續(xù)至

16、40分鐘仍保持較高表達，60分鐘時開始衰減。 4.BMSCs遷移能力的變化 H2O2預處理后能明顯增加BMSCs向SDF-1的遷移能力，PD98059能阻斷H2O2預處理增加的BMSCs遷移能力，但LY29004并不影響B(tài)MSCs遷移能力。 5.抑制劑對BMSCs表面CXCR4表達的影響 流式細胞儀結果：H2O2預處理組和H2O2預處理+PD98059組BMSCs表面CXCR4表達率分別為(27.53±