Vernodalol增強TRAIL誘導(dǎo)人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株細胞凋亡及其機制研究.pdf

1、目的:
　　1.以DLBCL細胞株為研究對象，明確Vern的是否存在抗淋巴瘤活性以及其能否增強TRAIL抗淋巴瘤作用。
　　2.探究DR5和DR4在Vern增強TRAIL誘導(dǎo)DLBCL細胞株細胞凋亡時的作用。
　　3.探究Vern是否以CHOP依賴模式增加DLBCL細胞株細胞DR5蛋白表達水平，以及CHOP在Vern增強TRAIL誘導(dǎo)DLBCL細胞株細胞凋亡時的作用。
　　4.探究MAPKs信號途徑在Vern增強

2、TRAIL誘導(dǎo)DLBCL細胞株細胞凋亡時的作用。
　　5.探究凋亡相關(guān)蛋白在Vern增強TRAIL誘導(dǎo)DLBCL細胞株細胞凋亡時的作用。
　　6.在BALB/c裸鼠模型中評價Vern是否能增強TRAIL抗DLBCL細胞株細胞作用。
　　方法:
　　1.不同濃度Vern聯(lián)合不同濃度TRAIL作用DLBCL細胞株Sudhl2、Sudhl4和Sudhl10細胞后，通過MTT方法測定細胞增殖力，流式細胞儀(FCM)Ann

3、exinⅤ/PI方法檢測細胞凋亡以及Western blot方法檢測caspase激活情況。
　　2.Vern作用Sudhl2細胞后，通過Western blot、FCM和real-time PCR等方法檢測DR4和DR5的蛋白，mRNA和表面受體表達變化情況;利用siRNA沉默DR4和DR5基因，用MTT和FCM AnnexinⅤ/PI方法分別檢測Vern、TRAIL以及兩者聯(lián)合作用對Sudhl2細胞增殖和凋亡的影響。
　

4、　3.通過Western blot和real-time PCR檢測不同濃度Vern作用Sudhl2細胞后CHOP蛋白和mRNA表達水平變化;分別用轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯抑制劑干預(yù)后，Western blot檢測Vern對CHOP蛋白表達水平變化;siRNA沉默CHOP基因后用Western blot檢測DR5和DR4蛋白表達水平變化;siRNA沉默CHOP基因后用MTT和FCMAnnexinⅤ/PI方法檢測Vern、TRAIL以及兩者聯(lián)合作用對Su

5、dhl2細胞增殖和凋亡的影響。
　　4.Vern作用Sudhl2細胞后，Western blot方法檢測p-ERK1/2、ERK1、p-JNK、JNK、p-P38和P38蛋白表達水平變化;p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)和ERK1/2抑制劑(PD98059)預(yù)處理Sudhl2細胞后，Western-blot檢測Vern對Sudhl2細胞CHOP和DR5蛋白表達水平影響。
　　5.Vern作用

6、Sudhl2細胞后，Westernblot方法檢測各種抗凋亡和促凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bad、Bak、Bax、Bid、XIAP、Survivin）蛋白表達水平變化;通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法，使Sudhl2細胞過表達Mcl-1蛋白，用MTT和FCMAnnexinⅤ/PI方法檢測Vern、TRAIL以及兩者聯(lián)合作用對Sudhl2細胞增殖和凋亡的影響;siRNA沉默Sudhl2細胞Mcl-1基因，用MTT和FCM Anne

7、xinⅤ/PI方法檢測TRAIL對細胞凋亡和增殖的影響。
　　6.在BALB/c裸鼠模型中，皮下注射Sudhl2細胞，待腫瘤直徑到3mm-5mm后，瘤體周邊分別注射Vern、TRAIL以及兩者聯(lián)合注射，觀察腫瘤體積、重量變化以及小鼠體重變化。
　　結(jié)果:
　　1.Vern聯(lián)合TRAIL能明顯抑制DLBCL細胞株Sudhl2、Sudhl4和Sudhl10細胞增殖，并能增強TRAIL誘導(dǎo)Sudhl2細胞凋亡作用。
　

8、　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只能誘導(dǎo)5％和10％左右的凋亡，兩者聯(lián)合凋亡率增加到30％左右;同時Western blot檢測到兩者聯(lián)合作用能激活caspase3，caspase8以及誘導(dǎo)PARP剪切。
　　2.Vern通過上調(diào)DR5蛋白表達來增強TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制細胞增殖作用。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA沉默DR5基因能阻斷Vern增加TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制增殖作用，而DR4基因被siRNA沉默不能阻斷上述作用。
　　3

9、.Vern以CHOP依賴模式增加Sudhl2細胞DR5蛋白表達水平。
　　不同濃度Vern（0μM、5μM、10μM和20μM）作用Sudhl2細胞24h，通過Westernblot和realtimePCR方法檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著Vern作用濃度增加CHOP蛋白表達和mRNA表達水平均逐漸上調(diào)，并且呈劑量依賴性。預(yù)先用10mM放線霉素D(ACT)和放線（菌）酮(CHX)處理Sudhl2細胞株細胞1h，然后用20μMVern作用Su

10、dhl2細胞24h，再用Westernblot檢測CHOP蛋白表達水平變化，發(fā)現(xiàn)ACT和CHX能在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯水平分別抑制Vern誘導(dǎo)的CHOP蛋白表達。利用siRNA沉默CHOP基因后，用Westernblot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vern(20μM)誘導(dǎo)Sudhl2細胞DR5表達上調(diào)作用被明顯抑制;分別以Vern(20μM)、TRAIL(20ng/ml)以及兩者聯(lián)合作用DMSO培養(yǎng)基組、CHOP siRNA組和Scramble siRNA組S

11、udhl2細胞24h，然后用FCM AnnexinⅤ/PI和MTT方法檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHOP siRNA組Vern增強TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制細胞增殖作用明顯被減弱，而其他兩組觀察不到Vern增強TRAIL上述作用被減弱。
　　4.Vern通過介導(dǎo)JNK磷酸化激活誘導(dǎo)CHOP和DR5表達上調(diào)。
　　20μM Vern作用Sudhl2細胞0h、0.Sh、2h和6h后，Western blot檢測p-ERK1/2、ERK1

12、、p-JNK、JNK、p-P38和P38蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERK和JNK被磷酸化激活，而P38沒有被磷酸化激活。預(yù)先用p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)和ERK1/2抑制劑(PD98059)作用Sudhl2細胞1h，然后用Vern（20μM）處理Sudhl2細胞24h，Western blot檢測CHOP和DR5蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JNK磷酸化抑制劑SP600125能以劑量依賴模式抑制CHOP和D

13、R5蛋白表達，而ERK1磷酸化抑制劑PD98059和p38磷酸化抑制劑SB202190對CHOP和DR5蛋白表達水平無影響。
　　5.下調(diào)Mcl-1表達與Vern增強TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制細胞增殖作用相關(guān)。
　　不同濃度Vern（0μM、5μM、10μM和20μM）作用Sudhl2細胞24h后，Westernblot檢測各種抗凋亡和促凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bad、Bak、Bax、Bid、XIA

14、P、Survivin)表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bad蛋白表達有輕微上調(diào)，Bcl-2表達有輕微下調(diào)，Mcl-1蛋白表達被明顯抑制，且呈劑量依賴性。Sudhl2細胞轉(zhuǎn)入過表達Mcl-1質(zhì)粒，然后分別以Vern（20μM）、TRAIL（20ng/ml）以及兩者聯(lián)合作用Sudhl2細胞24h，F(xiàn)CM AnnexinⅤ/PI方法檢測細胞凋亡，MTT檢測細胞抑制率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mcl-1蛋白過表達可以明顯減弱Vern增強TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制細胞增

15、殖作用。Sudhl2細胞轉(zhuǎn)入scramble siRNA或Mcl-1 siRNA，進一步用TRAIL(20 ng/ml)作用細胞24h，F(xiàn)CM AnnexinⅤ/PI和MTT方法檢測，發(fā)現(xiàn)Mcl-1基因被siRNA沉默后，TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制細胞增殖作用明顯增強，且能明顯誘導(dǎo)PRAP剪切。
　　6.在BALB/c裸鼠體內(nèi)DLBCL模型中Vern同樣能增強TRAIL對DLBCL細胞株細胞毒作用。
　　在BALB/c裸鼠

16、中，皮下注射Sudhl2細胞，待腫瘤直徑到3mm-5mm后，瘤體周邊分別以生理鹽水、Vern（2mg/kg）、TRAIL(2mg/kg)和兩者聯(lián)合注射，每3天一次，總共8次，結(jié)果顯示，Vern(2mg/kg)、TRAIL(2mg/kg)一定程度抑制Sudhl2細胞在BALB/c裸鼠體內(nèi)成瘤，聯(lián)合用藥組能明顯抑制Sudhl2細胞在BALB/c裸鼠體內(nèi)成瘤且不明顯減少小鼠體重。
　　結(jié)論:
　　1.Vern能增強TRAIL誘導(dǎo)D