Apatinib對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株的殺傷作用及分子機制的探討.pdf

1、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是成人最常見的淋巴系統(tǒng)腫瘤，占非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)的30-40％，是其最常見的一種亞型。DLBCL是一種異質(zhì)性很大的侵襲性惡性腫瘤，包括在組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及臨床預(yù)后方面。近年來，基于含有利妥昔單抗(rituximab)的聯(lián)合化療R-CHOP(rituximab，cyclophosph

2、amide，doxorubicin，vincristine，prednisolone)方案，DLBCL患者的治療效果顯著提高，生存期也明顯延長。然而在R-CHOP的治療下，仍有近1/3的難治復(fù)發(fā)患者，且只有很少的患者得益于挽救治療及自體造血干細(xì)胞移植(autologous stem cell transplantation，ASCT)。那么新的藥物對于治療DLBCL是迫切需要的，目前靶向藥物一直是惡性腫瘤研究的熱點。血管生成對腫瘤生長及

3、轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，選擇性的抑制血管生成已成為抗腫瘤治療的策略，目前越來越多的靶向血管生成藥物在臨床上運用于腫瘤。
　　Apatinib是一種靶向血管的抑制劑，為血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)酪氨酸激酶抑制劑;Apatinb能強效抑制腫瘤血管生成，主要作用機制是競爭性結(jié)合該受體胞內(nèi)酪氨酸ATP結(jié)合位點，高度選擇性地抑制VEGFR2酪氨酸激酶活性，阻斷VEGFR2與內(nèi)皮生長因子(VEGF)結(jié)合后的信號傳導(dǎo)。
　　VEGF

4、與VEGFR2結(jié)合后可以激活多種信號通路，包括PI3K/Akt、Ras通路等，而Ras通路與人類絕大多數(shù)腫瘤密切相關(guān)，也是VEGF/VEGFR2激活后重要的信號途徑。Apatinib作用于VEGFR2后，可以抑制VEGF/VEGFR2的激活，從而抑制其激活Ras信號通路，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。
　　目的:
　　探討Apatinib能否抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并進(jìn)一步研究其殺傷作用與Ras信號通路的關(guān)系，為開拓彌

5、漫大B細(xì)胞淋巴瘤治療新方法提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、用CCK-8法檢測不同濃度的(2.5、5、10、20、40μmol/L)Apatinib作用48h后對DLBCL細(xì)胞株的增殖抑制作用。
　　2、用Annexin-Ⅴ/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度的(0、10、20、30、40μmol/L)Apatinb處理48h后對DLBCL細(xì)胞株凋亡的影響。
　　3、利用蛋白免疫印跡法檢測Apatinib作用oc

6、i-ly1和細(xì)胞SU-DHL-248h后pVEGFR2蛋白及Ras信號通路中Ras、c-Raf、pMEK1/2和pErK1/2的表達(dá)變化。
　　4、統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS19.0軟件，由于均是小樣本數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，兩組獨立樣本均數(shù)的比較采用非參數(shù)檢驗（Mann-Whithey U檢驗）;多組間均數(shù)比較采用多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis H檢驗）。計量資料用Mean±SD表示，所有的檢驗分析均是雙側(cè)檢驗，檢驗水準(zhǔn)

7、為α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.CCK8結(jié)果顯示:Apatinib對GCB型DLBCL細(xì)胞株oci-ly1、SU-DHL-4(S4)及ABC細(xì)胞株oci-ly3、SU-DHL-2(S2)具有明顯的增殖抑制作用，并呈劑量依賴性。Apatinib作用oci-ly1、SU-DHL-4(S4)oci-ly3、SU-DHL-2(S2)細(xì)胞48h后，其IC50分別為（19.30±0.07）μmol/L、（18.15±0.15）μm

8、ol/L、（18.15±0.15）μmol/L、（15.29±0.13）μmol/L和（12.34±0.27）μmol/L，經(jīng)多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗Kruskal-Wallis H檢驗分析結(jié)果表明與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=16.460,P=0.006;x2=16.248,P=0.006;x2=16.460,P=0.006和x2=16.648,P=0.005)。
　　經(jīng)兩個獨立樣本非參數(shù)檢驗Mann-Whitney

9、U分析，ABC型細(xì)胞株oci-ly3的增殖抑制率分別明顯高于兩種GCB型細(xì)胞株oci-ly1和SU-DHL-4(S4)(P=0.047和P=0.047);同樣，另一株ABC型細(xì)胞株SU-DHL-2的增殖抑制率分別高于兩種GCB型細(xì)胞株oci-ly1和SU-DHL-4(S4)(P=0.047和P=0.047)。
　　2.AnnexinⅤ/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測Apatinib作用于GCB型DLBCL細(xì)胞株oci-ly1、SU-DH

10、L-4(S4)及ABC型細(xì)胞株oci-ly3，SU-DHL-2(S2)48h后的凋亡比例，發(fā)現(xiàn)Apatinib能夠誘導(dǎo)oci-ly1、SU-DHL-4(S4)、oci-ly3、SU-DHL-2(S2)細(xì)胞凋亡，呈濃度依賴性，經(jīng)多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗Kruskal-Wallis H檢驗分析，與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=12.767，P=0.012;x2=13.233，P=0.010;x2=13.033,P=0.011和x2=

11、12.933,P=0.012)。
　　兩種類型DLBCL細(xì)胞株的凋亡率的比較無統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)兩個獨立樣本非參數(shù)檢驗Mann-Whitney U分析，ABC型細(xì)胞株oci-ly3的凋亡率與兩種GCB型細(xì)胞株oci-ly1和SU-DHL-4(S4)比較均無明顯差異(P=0.275和P=0.06);同樣，另一株ABC型細(xì)胞株SU-DHL-2的凋亡率與GCB型細(xì)胞株oci-ly1和SU-DHL-4(S4)比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.275

12、和P=0.06)。
　　3.蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示Apatinib可通過抑制VEGFR2的自磷酸化即抑制pVEGFR2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制Ras(Ras、Raf、pMEK1/2、pErk1/2)信號通路。對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，經(jīng)多個獨立樣本非參數(shù)檢驗Kruskal-Wallis H檢驗，Apatinib組(20、40μmol/L)中pVEGFR2、Ras、c-Raf、pMEK1/2,pErk1/2蛋白表達(dá)水平與對照組（0μmol/

13、L）相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均x2=7.2，均P=0.027)
　　結(jié)論:
　　1.不同濃度的Apatinib能抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞oci-ly1、SU-DHL-4(S4)、oci-ly3、SU-DHL-4(S2)的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。且Apatinib對于ABC型的DLBCL細(xì)胞株的增殖抑制率效果更明顯。
　　2.Apatinib通過抑制VEGF與VEGFR2的結(jié)合，阻止VEGFR2發(fā)生自磷酸化成pVEGF