孕期炎癥刺激對子代大鼠心臟損傷危險因素敏感性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　心血管疾病是威脅人類健康的重要因素之一。目前，心血管疾病已經(jīng)超越腫瘤等慢性非傳染性疾病，成為全世界死亡率最高的疾病，其死亡率達(dá)到了31％。盡管針對治療和預(yù)防心血管疾病的研究和投入是所有慢性非傳染性疾病中最昂貴的，其發(fā)病率和死亡率仍然每年在增長，提示其他重要發(fā)病因素的存在。大量臨床和動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，孕期暴露于營養(yǎng)不良、缺氧等不利環(huán)境，會導(dǎo)致子代成年對心血管疾病的危險因素敏感性增高，從而更容易罹患心血管疾病，甚至誘發(fā)嚴(yán)重

2、的心血管事件。我室在利用脂多糖和酵母多糖成功構(gòu)建子代成年大鼠高血壓模型的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)孕中期接受脂多糖刺激，與正常組相比，其子代大鼠成年后隨年齡增長逐漸出現(xiàn)心肌纖維化和心肌重構(gòu)，并導(dǎo)致舒張功能下降，這種心肌重構(gòu)和舒張功能的下降可能與心臟NF-κB通路和心臟局部RAAS異常激活有關(guān)，但具體機(jī)制及其對子代成年心血管疾病易感性的影響仍不明確。目前，對于心臟疾病易感性的起因和機(jī)制研究主要集中在成年個體，因此，本研究結(jié)果可能擴(kuò)大心臟疾病預(yù)防和治療的

3、時間窗，將防治心臟疾病的時間追溯到了生命早期。
　　方法:
　　1.孕鼠處理方案:SD孕鼠隨機(jī)分為兩個組(每組9-10只):對照組、LPS組。LPS組孕鼠分別在孕第8、10、12天給予腹腔注射LPS0.79mg/kg，對照組孕鼠給予腹腔注射生理鹽水。子代大鼠三周齡斷奶，正常飼養(yǎng)至出生后第20周。
　　2.子代大鼠處理方案:對照組和LPS組的子代大鼠20周齡時，分別隨機(jī)分為4組(每組6只):LPS組子代大鼠分別給予皮下注

4、射生理鹽水，異丙腎上腺素(ISO)5mg/kg/day，皮下注射ISO+腹腔注射SB2021900.4mg/kg/day，皮下注射ISO+口服NAC2.5mg/kg/day，分別定義為LPS+Ve、LPS+ISO、LPS+ISO+SB202190和LPS+ISO+NAC組，對照組子代大鼠采取與LPS組子代大鼠一致的處理方式，定義為Con+Ve、Con+ISO、Con+ISO+SB202190和Con+ISO+NAC組，刺激時間為兩周。I

5、SO急性刺激實(shí)驗(yàn)中，對照組和LPS組的子代大鼠20周齡時，分別隨機(jī)分為2組(每組6只)，一次性分別給予皮下注射生理鹽水和ISO(5mg/kg)。
　　3.高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)評價子代大鼠心臟功能和心臟血流動力學(xué)。
　　4.HE染色法評價子代大鼠心肌細(xì)胞總體形態(tài)、心肌細(xì)胞大小;Masson三色染色法評價心肌纖維化和膠原沉積。
　　5.冰凍組織切片DHE熒光染色評價子代大鼠心臟活性氧簇表達(dá)。
　　6.Real-

6、time PCR檢測子代大鼠心臟左室組織中活性氧產(chǎn)生和清除相關(guān)基因(Nox2、Nox4、Sod1、Sod2)的mRNA表達(dá)情況和心肌肥厚和纖維化相關(guān)基因(α-MHC、β-MHC、ANP、BNP、Col1a1、Col3a1、Mmp2、Mmp9)的mRNA表達(dá)。
　　7.Western blot法檢測子代大鼠心臟組織中p38、JNK MAPK信號通路蛋白表達(dá)以及α-MHC、β-MHC等心肌重構(gòu)相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　

7、　1.孕期炎癥刺激對子代成年大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響
　　1.1與對照組子代大鼠相比，孕期炎癥刺激子代大鼠左室室間隔厚度(IVST)顯著增加、收縮末期左室內(nèi)徑(LVIDS)顯著降低(P＜0.05)，左室中膠原容積分?jǐn)?shù)(CFV％)、主要的膠原類型Col1a1和及其降解酶Mmp9表達(dá)增加(P＜0.05)，表明孕期炎癥刺激子代大鼠存在明顯的心肌重構(gòu)。
　　1.2與對照組子代大鼠相比，LPS孕期炎癥刺激子代大鼠心臟左室射血分?jǐn)?shù)(LV

8、EF％)、左室短軸縮短率(LVFS％)顯著升高(P＜0.05)，說明孕期炎癥刺激子代大鼠存在明顯心臟功能改變。
　　2.孕期炎癥刺激子代大鼠對ISO刺激心臟損傷敏感性增加
　　2.1 ISO刺激兩周，正常對照組子代大鼠心臟重量指數(shù)(HMI)和左心室重量指數(shù)(LVMI)明顯增加(P＜0.001)，但相同刺激下，孕期炎癥刺激子代大鼠HWI和LVMI顯著增加(P＜0.001)，且增加幅度明顯高于相同處理的對照組子代大鼠(P＜0.0

9、01)。
　　2.2 ISO刺激兩周，正常對照組子代大鼠左室與心肌肥厚相關(guān)的胚胎基因β-MHC表達(dá)降低(P＜0.05)、ANP表達(dá)增加(P＜0.01)、BNP和非胚胎基因α-MHC表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，α-MHC/β-MHC表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。而孕期炎癥刺激子代大鼠左室與心肌肥厚相關(guān)的胚胎基因β-MHC、ANP、BNP表達(dá)顯著增加(P＜0.01);與正常對照組子代大鼠不同的是，非胚胎基因α-MHC表達(dá)顯著降低(

10、P＜0.01)，α-MHC/β-MHC差異無論在mRNA水平和蛋白水平都顯著降低(P＜0.01)，且低于相同處理的對照組子代大鼠(P＜0.05)。這說明孕期炎癥刺激子代大鼠對ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚敏感性增加。
　　2.3 ISO刺激兩周，正常對照組子代大鼠膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF％)、左室中主要存在的膠原類型Col1a1、Col3a1及其降解酶Mmp2表達(dá)顯著增加(P＜0.01);相同刺激條件下，孕期炎癥刺激子代大鼠膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF

11、％)、左室中主要存在的膠原類型Col1a1、Col3a1及其降解酶Mmp2表達(dá)也顯著增加(P＜0.01)，且增加幅度高于相同處理的對照組子代大鼠(P＜0.05)。說明孕期炎癥刺激子代大鼠對ISO誘導(dǎo)的心肌纖維化敏感性增加。
　　3.孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代大鼠對ISO誘導(dǎo)的心臟損傷敏感性增加的機(jī)制研究
　　3.1 活性氧產(chǎn)生與清除失衡介導(dǎo)的孕期炎癥刺激子代大鼠對ISO誘導(dǎo)心臟損傷敏感性增加。
　　3.1.1 沒有ISO刺激

12、的情況下，通過超氧化物陰離子水平熒光探針DHE染色顯示，與對照組子代大鼠相比，孕期炎癥刺激子代大鼠心臟組織DHE熒光染色強(qiáng)度有增加趨勢，但無顯著差異。ISO連續(xù)刺激兩周，對照組子代大鼠心臟中DHE染色熒光強(qiáng)度顯著增加(P＜0.01)，孕期炎癥刺激子代大鼠心臟中DHE染色熒光強(qiáng)度也顯著增加(P＜0.001)，且顯著高于相同處理的對照組子代大鼠(P＜0.001)。
　　3.1.2 與正常對照組子代大鼠相比，孕期炎癥刺激子代大鼠左室中促

13、進(jìn)ROS生成的NADPH氧化酶(如Nox2、p47phox)mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，NOX2在蛋白水平表達(dá)也有增加趨勢，說明孕期炎癥刺激子代大鼠存在ROS激活。ISO刺激兩周后，對照組子代大鼠左室中促進(jìn)ROS生成的NADPH氧化酶(如Nox2、p67phox)mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.01)，Nox4和p22phoxmRNA表達(dá)也有增加趨勢，但無顯著差異;相同刺激條件下，孕期炎癥刺激子代大鼠左室中促進(jìn)ROS生成的NAD

14、PH氧化酶(如Nox2、p67phox、Nox4和p22phox)mRNA表達(dá)也顯著增加(P＜0.01)，且顯著高于相同刺激的對照組子代大鼠(P＜0.05 or0.01)。NOX2在蛋白水平的表達(dá)趨勢與mRNA水平一致。
　　3.1.3 與正常對照組子代大鼠相比，孕期炎癥刺激子代大鼠左室中促進(jìn)ROS清除的Sod1、Sod2、Sod3、catalase mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.05 or0.01)，SOD1蛋白表達(dá)水平也顯著增

15、加(P＜0.05)。ISO刺激兩周后，對照組子代大鼠左室中促進(jìn)ROS清除的Sod1、Sod2、Sod3、catalase mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05 or0.01)，而孕期炎癥刺激子代大鼠左室中促進(jìn)ROS清除的Sod1、Sod2、Sod3、catalase和Gpx-1 mRNA表達(dá)也顯著降低(P＜0.01 or0.001)，且低于相同刺激對照組子代大鼠的趨勢，但無顯著差異。SOD1和SOD2蛋白表達(dá)水平與mRNA水平一致。

16、>　　3.1.4 抗氧化劑NAC能降低ISO導(dǎo)致的孕期炎癥刺激子代大鼠心肌纖維化，提高心肌收縮能力。
　　3.2 p38 MAPK激活介導(dǎo)的孕期炎癥刺激子代大鼠對ISO誘導(dǎo)心臟損傷敏感性增加。
　　3.2.1 與正常對照組子代大鼠相比，孕期炎癥刺激子代大鼠左心室p-p38表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，說明孕期炎癥刺激子代大鼠左室中p38 MAPK被激活。
　　3.2.2 無論是否用ISO刺激，孕期炎癥刺激子代大鼠左室p

17、-p38表達(dá)比相同刺激的正常對照組子代大鼠顯著增加(P＜0.05)。ISO刺激兩周后，正常對照組和孕期炎癥刺激子代大鼠左室中p-p38表達(dá)都無顯著改變(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代成年大鼠對ISO誘導(dǎo)的心肌損傷敏感性增加，主要表現(xiàn)為左心室肥厚，心肌纖維化程度加重，左室收縮功能顯著降低。
　　2.活性氧生成與清除失衡是導(dǎo)致孕期炎癥刺激子代成年大鼠對ISO誘導(dǎo)的心肌損傷敏感性增加的機(jī)制之一，抗