七鰓鰻NF-κB1-like和IκB-ε-like的鑒定以及在固有免疫應答中作用的研究.pdf

1、哺乳動物核轉錄因子NF-κB家族蛋白在免疫系統(tǒng)中扮演著一個重要的角色，它通過調(diào)節(jié)與淋巴細胞發(fā)育以及生存相關的一些基因的表達，來參與免疫應答。IκBs家族蛋白作為NF-κB的一種抑制劑，它可以保持NF-κB為一種靜息的狀態(tài)。七鰓鰻作為脊椎動物上最低等的一個物種，為研究脊椎動物的起源提供了線索。雖然NF-κB信號通路在高等脊椎動物中研究較多，但是在七鰓鰻中的研究卻未見報道。經(jīng)過實驗室的工作，我們首次在七鰓鰻的淋巴細胞cDNA文庫中搜索到了與

2、高等哺乳動物NF-κB1和IκB-ε同源的EST序列，并克隆了2個基因的cDNA全長，命名為NF-κB1-like和IκB-ε-like。七鰓鰻NF-κB1-like cDNA全長序列帶有一個長度為2940bp，979個氨基酸的ORF區(qū)。含有一個171bp5'-UTR和一個1799-bp的3'-UTR，在3'-UTR末端含有一個多聚腺苷酸加尾信號(AATAAA)。七鰓鰻IκB-ε-like cDNA全長序列帶有一個長度為272bp，42

3、4個氨基酸的ORF區(qū)。而且還有一個354bp5'-UTR和一個2014-bp的3'-UTR，在3'-UTR末端也有一個多聚腺苷酸加尾信號。序列比對顯示，七鰓鰻NF-κB1-like和IκB-ε-like分別與高等脊椎動物中的對應基因有著很高的同源性。NF-κB1-like的N端帶有一個高度保守N端RHD結構域（Rel同源區(qū)），這是NF-κB家族的標志性結構域，在序列的中段含有一個甘氨酸富集區(qū)(GRR)，在序列的C端，存在7個高同源性錨定

4、蛋白重復序列(ANK)。IκB-ε-like在N端含有一個DSGxxS結構域，其在IκB-ε抑制NF-κB的方面發(fā)揮著重要的作用，在序列的C端含有6個保守的錨定蛋白重復序列。進化樹分析顯示，NF-κB1-like和IκB-ε-like分別被分到了NF-κB1和IκB-ε的那一簇，并且位于進化樹的最底端。
　　構建pET32a-NF-κB1-like2，pET32a-NF-κB1-like3和pET32a-IκB-ε-like原核表

5、達重組質(zhì)粒，進行表達分別得到58kDa，41kDa和36kDa重組原核蛋白。利用親和層析的方法對這些蛋白進行純化，并制備得兔抗IκB-ε-like，兔抗NF-κB1-like2，兔抗NF-κB1-like3和鼠抗NF-κB1-like2多克隆抗體。免疫印跡實驗表明，我們制備的抗體既識別重組表達的蛋白，也特異性識別七鰓鰻類淋巴細胞內(nèi)的蛋白。EMSA實驗結果表明七鰓鰻NF-κB1-like2蛋白具有特異性結合DNA的功能。構建pIRES2-

6、AcGFP1-NF-κB1-like2，pcDNA3.1-NF-κB1-like3和pcDNA3.1-IκB-ε-like真核表達載體，隨后轉染到HEK293T細胞中。RT-PCR實驗結果表明pIRES2-AcGFP1-NF-κB1-like2轉染后能夠促進L-6,IL-1和TNF-α轉錄水平的上調(diào)，而當共轉染pIRES2-AcGFP1-NF-κB1-like2和pcDNA3.1-NF-κB1-like3時這種作用又會減弱，這表明pcD

7、NA3.1-NF-κB1-like3對pIRES2-AcGFP1-NF-κB1-like2產(chǎn)生了抑制作用。除此之外，免疫共沉淀暗示，這種抑制通過二者的相互結合來實現(xiàn)。激光共聚焦結果顯示NF-κB1-like2可以入核表達，而且同樣這種入核會受到NF-κB1-like2蛋白的抑制。這一結果與western blot對于胞漿蛋白和胞核蛋白的分析相一致。為了研究NLS在NF-κB1-like中的作用，我們構建了NLS缺失的突變型質(zhì)粒pIRES

8、2-AcGFP1-NF-κB1-like1。激光共聚焦結果顯示，缺失了NLS的NF-κB1失去了入核的功能。七鰓鰻淋巴細胞在LPS持續(xù)免疫的作用下，IκB-ε-like會隨著時間的進行逐漸降解，這說明其參與了七鰓鰻的固有免疫應答且作用方式類似于哺乳動物的IκBs家族蛋白。免疫共沉淀和RT-PCR分析，NF-κB1-like和IκB-ε-like并不具有相互作用，并且IκB-ε-like不能夠顯著抑制NF-κB1-like的功能。

9、　　總之，本實驗室首次得到了七鰓鰻NF-κB1-like和IκB-ε-like cDNA全長序列。NF-κB1-like2通過RHD的結構，可以特異性結合DNA，并且能夠促進IL-6,IL-1和TNF-α基因轉錄水平的上調(diào)表達。而帶有ANK結構域的NF-κB1-like3蛋白可以通過和NF-κB1-like2蛋白的相互作用抑制其活性。當七鰓鰻淋巴細胞受到LPS刺激時，IκB-ε-like會逐漸降解。對這些試驗數(shù)據(jù)的分析指出，NF-κB1