紫草素在口腔鱗癌NF-κB信號通路中作用機(jī)制的研究.pdf

1、抗腫瘤治療一直是臨床上的一大難題，手術(shù)治療對早中期的實體瘤效果較好，但對晚期患者療效相對較差；放化療雖然有效，但毒副作用較大；基因治療前景很廣，但是離臨床實際應(yīng)用還有較長的距離；低毒高效的天然植物成分已經(jīng)成為抗腫瘤治療的新希望，當(dāng)今抗腫瘤藥物發(fā)展戰(zhàn)略之一即是從天然產(chǎn)物中尋找活性成分，特別是與現(xiàn)代分子生物學(xué)的進(jìn)展結(jié)合起來，期望進(jìn)一步提高腫瘤治療效果。 口腔鱗狀細(xì)胞癌是一種侵襲性較強(qiáng)的頭頸部上皮來源惡性腫瘤，近年來，在我國有發(fā)病率上

2、升且發(fā)病年齡年輕化的趨勢。盡管包括手術(shù)，放療以及化療在內(nèi)的各種治療手段都在不斷的改進(jìn)，口腔鱗癌患者的五年生存率仍徘徊在60％上下，晚期患者則僅為20～40％，術(shù)后造成的功能障礙和容貌破壞，亦給患者帶來了極大的心理負(fù)擔(dān)和生活障礙。因此，從天然植物中研究開發(fā)具有靶向性的低毒有效化學(xué)藥物，并最終應(yīng)用于臨床以提高口腔鱗癌尤其是晚期患者的生存率和生存質(zhì)量極為重要。 近年來大量研究表明：由天然植物紫草中提取出的小分子化合物紫草素可以從多個層

3、面上抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，相對于目前臨床應(yīng)用的化學(xué)制劑，其對人體的毒副作用較小，可能成為一種新型的低毒高效抗腫瘤藥物，具有良好的發(fā)展應(yīng)用前景。本研究擬通過實驗觀察，探討紫草素靶向治療口腔鱗癌的可行性及相關(guān)分子機(jī)制，為口腔鱗癌的有效防治探索新的途徑。 目的：觀察紫草素在體外對口腔鱗癌Tca-8113細(xì)胞系增殖，凋亡以及轉(zhuǎn)移侵襲等生物學(xué)行為的影響，重點研究NF-κB信號通路及其下游調(diào)控分子Bcl家族和Caspase家族在紫草素抗口腔

4、鱗癌過程中的參與機(jī)制，為今后的紫草素相關(guān)衍生物的合成改進(jìn)及臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法：1.以口腔鱗癌Tca-8113細(xì)胞為研究對象，正常口腔粘膜細(xì)胞作為對照，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法觀察紫草素對癌細(xì)胞的體外增殖抑制作用；采用光鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化；采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期；采用DNAladder及流式細(xì)胞AnnenxinV/PI染色檢測細(xì)胞凋亡情況。2.通過細(xì)胞運動遷移實驗、細(xì)胞粘附實驗和Transwel

5、l侵襲實驗觀察紫草素對Tca-8113細(xì)胞的體外黏附，運動及侵襲能力的影響，進(jìn)一步通過免疫細(xì)胞化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測紫草素對Tca-8113細(xì)胞MMP-2,9分泌和E-cadherin,CD44v6蛋白表達(dá)的影響。3.采用蛋白印跡法(Westernblot)檢測IκBa，磷酸化-IκBa蛋白的表達(dá)，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測p65蛋白的定位及表達(dá)，采用凝膠遷移滯后實驗(EMSA)檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性。4.采用蛋白印跡法(Wes

6、ternblot)檢測Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)，采用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)分析紫草素及泛Caspase抑制劑作用前后Caspase3，8，9的活性。 結(jié)果：1.MTT結(jié)果顯示，在10～50umol/L濃度范圍內(nèi)，紫草素對Tca-8113細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)明顯的時間和濃度依賴性，電鏡下可見典型的細(xì)胞核皺縮及凋亡小體，DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察到典型梯狀條帶，流式細(xì)胞儀定量分析結(jié)果顯示亞G1期細(xì)胞明顯增加，各實驗組細(xì)胞

7、凋亡率均明顯高于對照組。2.細(xì)胞運動遷移實驗、粘附實驗和Transwell侵襲實驗顯示紫草素對Tca-8113細(xì)胞的的體外黏附、運動及侵襲能力沒有顯著影響；免疫細(xì)胞化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附實驗表明紫草素作用后Tca-8113細(xì)胞MMP-2,9的分泌無明顯變化；E-cadherin蛋白的表達(dá)雖有增高趨勢，但與對照組相比未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)上的差異。3.Westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果顯示，紫草素處理后的口腔鱗癌Tca-8113細(xì)胞內(nèi)IκBa蛋

8、白和p65蛋白無明顯變化，但磷酸化-IκBa蛋白的表達(dá)水平卻明顯降低；EMSA結(jié)果顯示紫草素作用后，NF-κB的DNA結(jié)合活性受到明顯抑制。4.紫草素作用后，Tca-8113細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著減少，Caspase-3，-8,-9在紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中被激活，泛Caspase阻斷劑Z-Asp-CH2-DCB則可以明顯抑制紫草素引起的細(xì)胞增殖抑制及凋亡。 結(jié)論：1.紫草素對口腔鱗癌細(xì)胞系Tca-8113具有明顯的增

9、殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，可用于口腔鱗癌化學(xué)防治的新嘗試。2.紫草素對口腔鱗癌Tca-8113細(xì)胞系的體外黏附能力、運動遷移能力及侵襲能力均無明顯抑制作用，對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2,9的分泌也無明顯影響，但可以輕微的上調(diào)E-cad蛋白的表達(dá)，有通過化學(xué)改型而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的潛力。3.紫草素的誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡作用至少部分通過抑制NF-κB信號通路活性來實現(xiàn)，應(yīng)用紫草素特異性的抑制口腔鱗癌中高激活狀態(tài)的NF-κB通路可成為口腔鱗