豬鈣結(jié)合蛋白S100A9、S100A12在PCV2感染豬腎細(xì)胞(PK-15)中的功能研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒病是近年新發(fā)現(xiàn)的一種豬的傳染病，由豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PorcineCircovirus，PCV2)引起一種多系統(tǒng)功能障礙性疾病。1991年加拿大首次報道該病后，世界上許多國家和地區(qū)相繼報道了該病的發(fā)生和流行，它給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2不僅是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)的病原，而且能夠引起多種豬病如豬皮炎及腎病綜合征、豬增生性壞死性肺炎、豬呼吸與繁殖障礙綜合征等。
　　 鈣結(jié)合蛋白是一種小分子蛋

2、白家族。它與鈣離子結(jié)合，能夠調(diào)控多種重要的生理功能，如轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)、細(xì)胞生長分化、酶活性、炎性應(yīng)答等。鈣結(jié)合蛋白是鈣離子執(zhí)行生理功能過程中關(guān)鍵成分。豬源鈣結(jié)合蛋白S100A9和S100A12是相對分子量較小的蛋白，大小約為18.4kD和11.8kD。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，發(fā)現(xiàn)PCV2可以引起S100A9和S100A12這兩個基因的表達(dá)上調(diào)。有研究報道發(fā)現(xiàn)人S100A8/S100A9復(fù)合體可以通過NF-κB途徑放大由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性因子

3、，S100A12與受體結(jié)合后激活NF-κB細(xì)胞內(nèi)信號通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子和粘附分子調(diào)節(jié)促炎性作用，但是鼠S100A9卻可以抑制NF-κB的激活，而NF-κB是激活產(chǎn)生炎性應(yīng)答的重要轉(zhuǎn)錄因子，它的激活對于細(xì)胞抗病毒和抗感染有很重要的意義。本實(shí)驗(yàn)以豬S100A9和S100A12為研究對象，對它們是否也具有激活NF-κB功能，以及它們在PCV2增殖中的作用進(jìn)行了初步探討，結(jié)果如下：
　　 1.豬S100A9和S100A12基因的克隆

4、和多克隆抗體制備
　　 克隆了豬S100A9和S100A12基因的CDS全長序列，并且構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-S100A9和pGEX-KG-S100A12，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，成功制備小鼠抗S100A9和S100A12的多克隆抗體血清。
　　 2.豬S100A9和S100A12真核轉(zhuǎn)染以及亞細(xì)胞定位
　　 構(gòu)建豬S100A9和S100A12基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-S100A9和pEGFP-C1-S1

5、00A12，將真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞中并成功表達(dá)，經(jīng)激光共聚焦掃描顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)S100A9主要存在于細(xì)胞漿中，而S100A12在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中都有分布。
　　 3.豬S100A9和S100A12對PK-15細(xì)胞IκB以及IL-6、IL-8和IL-10表達(dá)的影響Western Blot檢測轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-S100A9和pEGFP-C1-S100A12的PK-15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)S100A9和S

6、100A12都抑制IκB的表達(dá)，Real-Time PCR檢測發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-8和IL-10的表達(dá)也均被抑制，由于IκB和IL-6、IL-8和IL-10分別為NF-κB信號通路的上下游因子，表明S100A9和S100A12都可以抑制NF-κB激活，并且S100A12的抑制效果更明顯。
　　 4.PCV2感染對PK-15細(xì)胞S100A9和S100A12表達(dá)的影響
　　 將PCV2與PK-15細(xì)胞同步接種，在PCV2的作

7、用下，PK-15細(xì)胞中S100A9、S100A12的mRNA表達(dá)水平均顯著升高(p≤0.05或p≤0.01)。隨著時間的推移，它們的mRNA表達(dá)呈下降趨勢，在48h時又再次顯著上升。該實(shí)驗(yàn)表明PCV2會引起細(xì)胞中S100A9和S100A12的表達(dá)上升，并呈時間相關(guān)性。
　　 5.豬S100A9和S100A12對PCV2增殖的影響
　　 將將真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-S100A9和pEGFP-C1-S100A12轉(zhuǎn)染到

8、PK-15細(xì)胞中，24h后在熒光顯微鏡下觀察到目的基因表達(dá)后接種PCV2病毒。實(shí)驗(yàn)表明S100A9和S100A12都有助于PCV2在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，差異顯著(p≤0.01)。但S100A9的促進(jìn)作用隨著時間而下降，在12、24、36h時PCV2的拷貝數(shù)分別是對照組的1.76、1.12、1.54倍，24、36h表現(xiàn)與對照組無差異；S100A12則顯著促進(jìn)PCV2在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，并且隨著時間變化，這種促進(jìn)作用持續(xù)穩(wěn)定，在12、24、36h時P