鈍頂螺旋藻耐鹽相關(guān)基因的發(fā)掘及其功能驗證.pdf

1、答辯委員會主席： 堊態(tài)答辯委員會成員： 夏直拯堂圈羞論文答辯日期： 2 Q 1 2 生5 且1 8 目溫州I 醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文鈍頂螺旋藻耐鹽相關(guān)基因的發(fā)掘及其功能驗證中文摘要目的本研究旨在| 三l 集胞藻P C C 6 9 0 3 為宿主，通過基囡敲除與回補實驗，獲得鈍頂螺旋藻中耐鹽相關(guān)基因。同時利用G F P 作為報告基園建立p K W l l 8 8 同源重組雙交換平臺，研究螺旋藻耐鹽相關(guān)基因啟動子區(qū)域的起始轉(zhuǎn)錄功能，為后續(xù)鈍頂螺

2、旋藻耐鹽相關(guān)基因的研究奠定基礎(chǔ)。方法對螺旋藻蛋白質(zhì)組結(jié)果進行生物信息學(xué)分析得到耐鹽基因及其上游約2 5 0 b p D N A 序列。利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒( 啟動子+ g 鏟} 卡那抗性篩選標記) ，建立p K W l l 8 8 同源重組雙交換平臺，轉(zhuǎn)化集胞藻，在激光菇聚焦顯微鏡下測定其熒光強度，同時用熒光分光光度計測量不同鹽濃度下G F P 的誘導(dǎo)表達情況。同時構(gòu)建靶基因的敲除載體p L K R ( p M D 一，妒jk

3、a n ' ．' ．- r 嘞，) 及回補載體p K W - g e n e ：：C m 7 ．轉(zhuǎn)化集胞藻P C C 6 8 0 3 ，通過同源重組雙交換得到敲除藻及回補藻。利用分光光度計測定不同鹽濃度下藻的生長情況，并以此來判斷差異表達基因是否為耐鹽相關(guān)基因。結(jié)果1 在預(yù)測螺旋藻耐鹽基因的啟動子區(qū)域基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了3 個以p K W l 1 8 8為載體、含有螺旋藻啟動子區(qū)域( p r o ) 、G F P 蛋白基因

4、( e ／p ) 和卡那霉素抗性基因( b a n ) 的重組載體( p K W - p r o ：：g f p ：：k a n r ) ，轉(zhuǎn)化集胞藻，并利用報告基因技術(shù)對這些啟動子的轉(zhuǎn)錄活性進行了檢測．證實啟動子p r o ．s p i - 0 4 9 ，p r o - 5 p i 一2 9 5 和p r o - s p i - 3 0 2 均具有起始轉(zhuǎn)錄活性，且可被N a C I誘導(dǎo)，驗證了上述三個啟動子具有啟動功能。2 利用分子克

5、隆技術(shù)將1 2 個集胞藻基因的上下游1 0 0 0 b D 片段及卡那抗性基因克隆到p M D l 8 - T 載體，獲得了2 7 個含不同插入片段的克隆。同時得到8 個完整的敲除載體p L K R ( p M D —f P ^ ：：k a K ：：r i g h l ) 。3 敲除載體1 3 0 8 ．p L K R 轉(zhuǎn)化野生集胞藻得到靶基因，j ∞敲除的突變體藻，它在10 M N a C I 下不能生長，初步推測該基因為耐鹽相關(guān)基因