擬南芥隱花素CRY1在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能分析及激活標(biāo)簽突變體庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程受到多種外界環(huán)境因素影響，光作為主要的環(huán)境因子，不僅提供光合作用所需能量，而且在植物光形態(tài)建成等多個(gè)過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。
　　 高等植物進(jìn)化具備了一套極其精細(xì)的光感受和信號(hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，以監(jiān)視光信號(hào)的方向、量和質(zhì)，并調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。大量研究表明，藍(lán)光受體隱花素CRY1 在介導(dǎo)藍(lán)光調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，包括抑制下胚軸伸長(zhǎng)、刺激子葉展開(kāi)、氣孔開(kāi)啟、花青素的積累以及調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)等。隨著研究的深入

2、，進(jìn)一步研究隱花素CRY1 在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的生物學(xué)功能以及分離、鑒定與隱花素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的組分對(duì)闡明其作用機(jī)制十分重要。本論文通過(guò)不同的光處理，探討隱花素CRY1 在植物亞細(xì)胞中的定位及受光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移的過(guò)程。在此基礎(chǔ)上，以隱花素cry1-304 突變體為研究背景構(gòu)建CRY1-GR/cry1-304 轉(zhuǎn)基因植株，采用外源糖皮質(zhì)激素控制隱花素CRY1 在細(xì)胞核--細(xì)胞質(zhì)間的分布，以期闡明隱花素CRY1 在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的生物學(xué)功能。最后，以隱花

3、素cry1cry2 突變體為研究背景構(gòu)建了激活標(biāo)簽突變體庫(kù)，分離、鑒定與隱花素下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的組分。通過(guò)遺傳、分析等方法，主要取得以下結(jié)果：
　　 1.將35S::CRY1-GFP 轉(zhuǎn)基因植株在黑暗中培養(yǎng)5天后，采用不同的光處理，實(shí)時(shí)觀(guān)察CRY1-GFP 融合蛋白在亞細(xì)胞中的定位及受光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移過(guò)程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：
　　 黑暗條件下CRY1-GFP 融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中且熒光強(qiáng)度非常微弱；隨著藍(lán)光處理時(shí)間的延長(zhǎng)和光強(qiáng)的增大

4、，GFP 熒光逐漸增強(qiáng)，在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核）中均有表達(dá)，實(shí)驗(yàn)表明CRY1蛋白表達(dá)受藍(lán)光誘導(dǎo)，且與光照時(shí)間和強(qiáng)度成正比。在藍(lán)光處理過(guò)程中（0-15 min），CRY1-GFP 融合蛋白從細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移聚集；藍(lán)光處理15 min 時(shí)，細(xì)胞核中GFP 熒光強(qiáng)度達(dá)到最高，且細(xì)胞核與細(xì)胞GFP 平均熒光強(qiáng)度的比值達(dá)到峰值。蛋白免疫雜交結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，在藍(lán)光下（0-15 min）GFP蛋白表達(dá)與藍(lán)光處理時(shí)間成正比。實(shí)

5、驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)：CRY1-GFP 融合蛋白在藍(lán)光誘導(dǎo)下，由細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移累積，這種轉(zhuǎn)移與紅光無(wú)關(guān)。
　　 2.將黑暗中培養(yǎng)5天的野生型黃化苗采用不同的光照處理30 min，提取細(xì)胞核蛋白。蛋白免疫雜交檢測(cè)隱花素CRY1蛋白表達(dá)量顯示：藍(lán)光下，細(xì)胞核內(nèi)CRY1蛋白表達(dá)量比黑暗、紅光高，黑暗條件下CRY1蛋白表達(dá)量最低。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞核內(nèi)隱花素CRY1蛋白特異性受藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)，或CRY1蛋白受藍(lán)光誘導(dǎo)完成由細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞

6、膜向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移過(guò)程。3.以隱花素cry1-304 突變體為研究背景，成功構(gòu)建了CRY1-GR/cry1-304 轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：CRY1-GR/cry1-304 轉(zhuǎn)基因植株僅在藍(lán)光和外源糖皮質(zhì)激素同時(shí)存在的條件下回復(fù)野生型表型，包括抑制下胚軸的伸長(zhǎng)、子葉的展開(kāi)、花青素的累積及氣孔的開(kāi)啟等。實(shí)驗(yàn)證實(shí)：核定位信號(hào)（NLS）和光子激活兩要素是隱花素CRY1 在細(xì)胞核中發(fā)揮生理功能的充分必要條件。實(shí)驗(yàn)首次將糖皮質(zhì)受體GR作用機(jī)理運(yùn)用到隱

7、花素CRY1基因功能研究，并證實(shí)細(xì)胞核隱花素CRY1 與下胚軸的伸長(zhǎng)、氣孔的開(kāi)啟相關(guān)；細(xì)胞質(zhì)隱花素CRY1 與子葉的展開(kāi)、葉柄的伸長(zhǎng)和花青素的積累相關(guān)。
　　 4.以隱花素cry1cry2突變體為研究背景，構(gòu)建了基因功能獲得型T-DNA突變體庫(kù)，獲得了近2 000個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系。從T1代轉(zhuǎn)基因植株中篩選獲得35個(gè)株系，與cry1cry2突變體表型明顯不同。從中篩選得到一組有價(jià)值的光周期開(kāi)花突變體，為進(jìn)一步研究隱花素與植物光形態(tài)建

8、成提供了寶貴實(shí)驗(yàn)材料。采用IPCR法，成功獲得了Scc101-D突變體基因組T-DNA插入位點(diǎn)旁鄰序列。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Scc101-D突變體晚花的表型是與At5g28237基因超量表達(dá)相關(guān)。
　　 5.以野生型為研究背景構(gòu)建AT5G28237過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，該轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)花延遲，進(jìn)一步證實(shí)Scc101-D突變體晚花表型是由AT5G28237基因超量表達(dá)所致。
　　 基因槍轟擊洋蔥表皮實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)該基因定位在細(xì)胞質(zhì)中，且無(wú)