NF-κBp65在IL-17上調MCP-1表達中的影響作用研究.pdf

1、IL-17是自身免疫性疾病的早期炎癥因子，能夠通過促進多種趨化因子的表達誘導疾病的進一步發(fā)展。單核細胞趨化因子-1（monocytechemoattractantprotein1,MCP-1）是一種常見的趨化因子，可以誘導單個核細胞在病毒性心肌炎(Viralmyocarditis,VMC)心肌細胞中的浸潤，我們前期研究發(fā)現IL-17和MCP-1在VMC心肌細胞的損傷中起重要作用，且IL-17能夠通過上調MCP-1的表達而加重心肌細胞的損

2、傷，但關于IL-17是通過什么信號途徑誘導MCP-1的表達的目前還不清楚。
　　NF-κB是調控炎癥反應的重要核轉錄因子，廣泛存在于多種信號傳導通路中。有研究報道，多種細胞中IL-17能誘導NF-κB的激活，同時在某些細胞中激活的NF-κB能誘導MCP-1的表達。然而，在心肌細胞中，IL-17是否通過轉錄因子NF-κB的激活而上調MCP-1的表達，目前尚未見文獻報道。我們通過TFSearch軟件預測MCP-1啟動序列中的存在的轉錄

3、因子結合位點，發(fā)現MCP-1啟動序列中存在NF-κB結合位點，基于以上認識和我們前期的研究，預測IL-17可能通過激活NF-κB上調MCP-1的表達，從而參與VMC的發(fā)生發(fā)展。
　　目的：
　　研究NF-κBp65在IL-17誘導MCP-1表達增高中的影響作用，為病毒性心肌炎的治療提供新的靶點。
　　方法：
　　1．差速貼壁法分離BALB/c小鼠心肌細胞，并進行心肌細胞原代培養(yǎng)。
　　2．設計合成三對針對小

4、鼠MCP-1啟動序列中NF-κBp65的siRNA和陰性對照siRNA，實時熒光定量PCR（qPCR）篩選出干擾效率最高的干擾序列和最適干擾濃度。
　　3．WesternBlot檢測IL-17（50ng/mL）作用不同時間后磷酸化p65（p-p65）和p65蛋白含量。
　　4．qPCR分析p65siRNA轉染后IL-17作用下MCP-1mRNA的含量變化。
　　5．酶聯免疫吸附法（ELISA）分析p65siRNA轉染后

5、IL-17誘導下MCP-1蛋白的含量變化。
　　6．采用SPSS17.0軟件進行數據統計分析，用單因素方差進行組間比較，兩組間比較用LSD-t，檢驗水準為α=0.05。
　　結果：
　　1．IL-17作用下心肌細胞中NF-κBp65和p-p65含量分析。IL-17作用小鼠心肌細胞5min、15min、30min后，各時間點心肌細胞中p65蛋白含量均無明顯變化（P>0.05），而p-p65蛋白含量從IL-17作用后逐漸增

6、加，至15min達到峰值（P<0.05），隨后逐漸下降，到30min時p-p65蛋白水平與對照組無明顯差異（P>0.05）。
　　2．NF-κBp65siRNA序列的篩選。轉染p65siRNA-1、p65siRNA-2、p65siRNA-3組與轉染陰性對照siRNA組比較，p65含量都有不同程度的下降(P<0.01)，但轉染p65siRNA-2組的p65mRNA下降最明顯，說明p65siRNA-2干擾效率最高，因此后續(xù)試驗將采用此

7、序列作為干擾序列。
　　3．NF-κBp65siRNA最適干擾濃度的篩選。轉染終濃度為5nM、10nM、20nM、50nM的p65siRNA-2組與轉染陰性對照siRNA組相比，各濃度組p65mRNA含量都有不同程度的下降(P<0.05)，但轉染終濃度為10nM時p65mRNA下降最明顯，說明此濃度為最適干擾濃度，因此后續(xù)試驗將采用此濃度作為干擾濃度。
　　4．NF-κBp65在IL-17誘導MCP-1mRNA表達中的作用。

8、轉染陰性對照siRNA組與空白對照組比較，MCP-1mRNA表達水平無明顯變化（P>0.05）；轉染p65siRNA-2組與轉染陰性對照siRNA組比較，MCP-1mRNA表達明顯下降（P<0.05）；轉染陰性對照siRNA+IL-17組與轉染陰性對照siRNA組比較，MCP-1mRNA表達水平明顯增加(P<0.05)；轉染P65siRNA-2+IL17組與轉染陰性對照siRNA+IL-17組比較MCP-1mRNA表達水平明顯降低(P<

9、0.05)。
　　5．NF-κBp65在IL-17誘導MCP-1蛋白表達中的作用。轉染陰性對照siRNA組與空白對照組比較，MCP-1蛋白表達水平無明顯變化（P>0.05）；轉染p65siRNA-2組與轉染陰性對照siRNA組比較，MCP-1蛋白表達明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）；轉染陰性對照siRNA+IL-17組與轉染陰性對照siRNA組比較，MCP-1蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)；轉染P65siRNA-2