NF-κBp65在IL-17上調(diào)MCP-1表達(dá)中的影響作用研究.pdf

1、IL-17是自身免疫性疾病的早期炎癥因子，能夠通過促進(jìn)多種趨化因子的表達(dá)誘導(dǎo)疾病的進(jìn)一步發(fā)展。單核細(xì)胞趨化因子-1（monocytechemoattractantprotein1,MCP-1）是一種常見的趨化因子，可以誘導(dǎo)單個核細(xì)胞在病毒性心肌炎(Viralmyocarditis,VMC)心肌細(xì)胞中的浸潤，我們前期研究發(fā)現(xiàn)IL-17和MCP-1在VMC心肌細(xì)胞的損傷中起重要作用，且IL-17能夠通過上調(diào)MCP-1的表達(dá)而加重心肌細(xì)胞的損

2、傷，但關(guān)于IL-17是通過什么信號途徑誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá)的目前還不清楚。
　　NF-κB是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于多種信號傳導(dǎo)通路中。有研究報道，多種細(xì)胞中IL-17能誘導(dǎo)NF-κB的激活，同時在某些細(xì)胞中激活的NF-κB能誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá)。然而，在心肌細(xì)胞中，IL-17是否通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活而上調(diào)MCP-1的表達(dá)，目前尚未見文獻(xiàn)報道。我們通過TFSearch軟件預(yù)測MCP-1啟動序列中的存在的轉(zhuǎn)錄

3、因子結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)MCP-1啟動序列中存在NF-κB結(jié)合位點，基于以上認(rèn)識和我們前期的研究，預(yù)測IL-17可能通過激活NF-κB上調(diào)MCP-1的表達(dá)，從而參與VMC的發(fā)生發(fā)展。
　　目的：
　　研究NF-κBp65在IL-17誘導(dǎo)MCP-1表達(dá)增高中的影響作用，為病毒性心肌炎的治療提供新的靶點。
　　方法：
　　1．差速貼壁法分離BALB/c小鼠心肌細(xì)胞，并進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)。
　　2．設(shè)計合成三對針對小

4、鼠MCP-1啟動序列中NF-κBp65的siRNA和陰性對照siRNA，實時熒光定量PCR（qPCR）篩選出干擾效率最高的干擾序列和最適干擾濃度。
　　3．WesternBlot檢測IL-17（50ng/mL）作用不同時間后磷酸化p65（p-p65）和p65蛋白含量。
　　4．qPCR分析p65siRNA轉(zhuǎn)染后IL-17作用下MCP-1mRNA的含量變化。
　　5．酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）分析p65siRNA轉(zhuǎn)染后

5、IL-17誘導(dǎo)下MCP-1蛋白的含量變化。
　　6．采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用單因素方差進(jìn)行組間比較，兩組間比較用LSD-t，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1．IL-17作用下心肌細(xì)胞中NF-κBp65和p-p65含量分析。IL-17作用小鼠心肌細(xì)胞5min、15min、30min后，各時間點心肌細(xì)胞中p65蛋白含量均無明顯變化（P>0.05），而p-p65蛋白含量從IL-17作用后逐漸增

6、加，至15min達(dá)到峰值（P<0.05），隨后逐漸下降，到30min時p-p65蛋白水平與對照組無明顯差異（P>0.05）。
　　2．NF-κBp65siRNA序列的篩選。轉(zhuǎn)染p65siRNA-1、p65siRNA-2、p65siRNA-3組與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組比較，p65含量都有不同程度的下降(P<0.01)，但轉(zhuǎn)染p65siRNA-2組的p65mRNA下降最明顯，說明p65siRNA-2干擾效率最高，因此后續(xù)試驗將采用此

7、序列作為干擾序列。
　　3．NF-κBp65siRNA最適干擾濃度的篩選。轉(zhuǎn)染終濃度為5nM、10nM、20nM、50nM的p65siRNA-2組與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組相比，各濃度組p65mRNA含量都有不同程度的下降(P<0.05)，但轉(zhuǎn)染終濃度為10nM時p65mRNA下降最明顯，說明此濃度為最適干擾濃度，因此后續(xù)試驗將采用此濃度作為干擾濃度。
　　4．NF-κBp65在IL-17誘導(dǎo)MCP-1mRNA表達(dá)中的作用。

8、轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組與空白對照組比較，MCP-1mRNA表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05）；轉(zhuǎn)染p65siRNA-2組與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組比較，MCP-1mRNA表達(dá)明顯下降（P<0.05）；轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA+IL-17組與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組比較，MCP-1mRNA表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；轉(zhuǎn)染P65siRNA-2+IL17組與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA+IL-17組比較MCP-1mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<

9、0.05)。
　　5．NF-κBp65在IL-17誘導(dǎo)MCP-1蛋白表達(dá)中的作用。轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組與空白對照組比較，MCP-1蛋白表達(dá)水平無明顯變化（P>0.05）；轉(zhuǎn)染p65siRNA-2組與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組比較，MCP-1蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA+IL-17組與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組比較，MCP-1蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；轉(zhuǎn)染P65siRNA-2