食管鱗癌中NF-κBp65對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是多細胞生物器官形成的基本過程。近來發(fā)現(xiàn)，這一過程和許多疾病存在聯(lián)系，包括各種纖維化疾病及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。最初在上皮類型細胞系中進行的關(guān)于EMT發(fā)生機制的研究表明：在上皮極性消失及問質(zhì)特性獲得的過程中，有多種信號傳導通路的參與。上皮型細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)型細胞，其表型發(fā)生變化、細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、細胞間黏附力下降及細胞遷徙能力增強。通常用來驗證EM

2、T過程發(fā)生的分子學標志物包括：問質(zhì)型標記基因N-cadherin和Vimentin表達的增加、β-catenin的核內(nèi)轉(zhuǎn)移，以及上皮型標志基因E-cadherin和Cytokeratin的表達下降。 核轉(zhuǎn)錄因子-<,к>B(nuclear transcription factor kappa B，NF-<,к>B)在多種人類腫瘤中高表達，不同的NF-<,к>B家族成員可以結(jié)合成不同的二聚體。在這些二聚體中，最常見的形式是由p5

3、0和p65組成的異源二聚體。NF-<,к>B的激活在細胞生存、粘附、分化和細胞生長中起關(guān)鍵作用，有研究顯示，在一些人類腫瘤，如肝癌、腸癌和宮頸癌中NF-<,к>B信號通路的激活在腫瘤的發(fā)生中起著重要作用。 研究表明：在乳腺上皮細胞中誘導EMT發(fā)生時，NF-<,к>B是必須的。細胞喪失NF-<,к>B活性后將無法逃避TGF-β誘導的凋亡，且EMT相關(guān)基因的表達亦受到抑制，從而阻斷EMT過程。相反，激活此通路可以在缺乏TGF-β的

4、情況下促使細胞向間葉細胞形態(tài)的轉(zhuǎn)化。此外，在間質(zhì)表型的細胞中抑制NF-<,к>B的活性可以導致EMT過程的逆轉(zhuǎn)，提示NF-<,к>B對誘導和維持EMT是必須的。 食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，尤其在中國河南的林縣，食管癌的發(fā)生率和死亡率均較高。本實驗為了證實食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)生了EMT，檢測了100例食管鱗癌組織和食管鱗癌細胞系EC9706中E-cadherin和Vimentin的蛋白表達情況。并且，以EC9706

5、為對象，采用陽離子聚合物介導的反義寡核苷酸(ASODN)技術(shù)，特異性地抑制NF-κB p65亞單位，研究NF-κBp65受到抑制前后，細胞內(nèi)E-cadherin和Vimentin的表達情況，探討NF-κB與食管鱗癌中EMT的關(guān)系，以及NF-κBp65 ASODN對食管鱗癌細胞增殖、凋亡、周期及遷徙能力的影響，探討NF-κB信號通路能否成為食管鱗癌治療的靶點，為食管癌的基因治療提供理論基礎(chǔ)。 材料和方法： 1．采用免疫組

6、織化學技術(shù)(IHC)檢測100例食管鱗癌組織及食管正常鱗狀上皮中E-cadherin及Vimentin蛋白的表達情況。 2．采用RT-PCR方法和免疫細胞化學(ICC)、流式細胞術(shù)(FCM)檢測食管鱗癌細胞系EC9706中NF-κBp65、E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白的表達情況。 3．針對NF-κBp65轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的寡核苷酸序列設(shè)計合成反義寡核苷酸(ASODN)、正義寡核苷酸(SODN)和一條無

7、關(guān)序列寡核苷酸(NSODN)。采用陽離子聚合物介導的寡核苷酸轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞EC9706。 3．1觀察NF-κBp65 ASODN對EC9706細胞形態(tài)的影響。 3．2采用RT-PCR方法、免疫細胞化學和流式細胞術(shù)觀察轉(zhuǎn)染NF-κBp65ASODN的EC9706與對照組相比，NF-κBp65 mRNA及蛋白表達的變化。 3．3采用RT-PCR方法、免疫細胞化學方法和流式細胞術(shù)觀察NF-κB3p65AS

8、ODN對EC9706細胞中E-cadherin與Vimentin mRNA及蛋白表達的影響。 3．4采用細胞劃痕實驗檢測NF-κBp65 ASODN對EC9706細胞遷移能力的影響。 4．采用流式細胞術(shù)檢測NF-κB3p65 ASODN對EC9706凋亡及細胞周期的影響；MTT法檢測轉(zhuǎn)染后各組EC9706細胞的增殖情況，。 5．統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料計算陽性率，計

9、量資料采用X+S表示；陽性率之間的比較采用x<'2>檢驗(chi-square)； 結(jié)果 1.E-cadherin蛋白在食管癌中的表達(43﹪)明顯低于食管正常粘膜中的表達(85﹪)(P<0.01)，Vimentin蛋白在食管癌中的表達(23﹪)明顯高于食管正常粘膜中的表達(0﹪)(P0.05)，兩者的表達呈負相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)T<,b>=-0.379。 2．RT-PCR法、免疫細胞化學和流式細胞術(shù)結(jié)果顯示： E

10、C9706細胞中，NF-кBp65在mRNA(0.448±0.045)和蛋白水平(ICC：17.154±1.78﹪：FCM：15.76﹪)均有表達；E-cadherin在mRNA(0.218±0.065)和蛋白水平(ICC：14.444±1.65﹪；FCM：12.22﹪)有表達；Vimentin在mRNA(0.893±0.089)和蛋白水平(ICC：19.52±1.07﹪；FCM：17.76﹪)有表達。 3.轉(zhuǎn)染72h后，RT

11、-PCR表明：轉(zhuǎn)染NF-кBp65 ASODN的細胞組中NF-кBp65mRNA的表達水平(0.135±0.060)明顯低于EC9706對照組(0.448±0.045)(P<0.01)。免疫細胞化學結(jié)果表明NF-кBp65陽性細胞數(shù)量(11.354±1.32﹪)較EC9706對照組(17.15±1.78﹪)減少(P<0.01)，細胞漿著色減弱。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染NF-кBp65 ASODN的EC9706細胞中p65蛋白陽性表達

12、率(11.78﹪)明顯低于其在EC9706對照組(15.76﹪)中的表達(P0.01)。 4.ASODN轉(zhuǎn)染組EC9706細胞E-cadherin mRNA的表達(0.3604±0.084)明顯高于EC9706對照組(0.218±0.065)(P<0.01)，而Vimentin mRNA的表達(0.753±0.066)明顯低于EC9706對照組(0.8934±0.089)(P<0.01)。免疫細胞化學結(jié)果顯示：反義組中E-ca

13、dherin的表達率(16.21±2.64﹪)較EC9706對照組(14.4±1.65﹪)上調(diào)(P<0.05)；Vimentin的表達率(17.33±1.76﹪)較EC9706對照組(19.52±1.07﹪)下調(diào)(P<0.01)。流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后的EC9706細胞內(nèi)E-cadherin及Vimentin蛋白的表達，反義組中E-cadherin的表達(14.98﹪)高于對照組(12.22﹪)(P<0.05)，而Vimentin的表達(

14、12.90﹪)則比對照組(17.76﹪)顯著性降低(P<0.01)。 5．與對照組相比，轉(zhuǎn)染NF-<,к>Bp65 ASODN的EC9706細胞的相對遷移距離在48h(0．324±0.06)、72h(0．45±0.08)均較EC9706對照組(48h：0．694±0．12，72h：0．814±0．11)顯著減弱(P<0.01)。 6．流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期的情況，結(jié)果表明：反義組細胞凋亡百分率(1．38﹪)

15、較EC9706對照組(0．96﹪)顯著性升高(P<0.01)；反義組G1期的細胞數(shù)(78．5﹪)較EC9706對照組(66．5﹪)高(P<0.01)， S期細胞數(shù)(12．2﹪)較EC9706對照組低(23．7﹪)(P<0.01)。MTT結(jié)果顯示：NF-<,к>Bp65 ASODN轉(zhuǎn)染組細胞(48h：0．34±0.04；72h:0．45±0.09)較EC9706對照組(48h：0．384±0.04；72h：0．53±0.09)增殖減慢(P

16、<0.05)。 結(jié)論： 1．食管癌組織中存在上皮性標志物E-cadherin的表達下調(diào)及間質(zhì)性標志物Vimentin的表達上調(diào)，兩者呈負相關(guān)關(guān)系。提示在食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在上皮-問質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。 2．NF-<,к>Bp65 ASODN可以特異性抑制細胞內(nèi)NF-<,к>Bp65 mRNA及蛋白的表達。 3．轉(zhuǎn)染NF-<,к>Bp65 ASODN 72h的EC9706細胞中，E-cadher