市售鹿茸片、蜈蚣的DNA條形碼及蜈蚣特異性位點(diǎn)的研究.pdf

1、目的：確定鹿茸切片、蜈蚣適宜的DNA提取方法，考察DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于市售鹿茸切片、蜈蚣藥材鑒別的可行性，以測(cè)得的線粒體COⅠ序列為基礎(chǔ)，探討特異性PCR技術(shù)鑒定蜈蚣藥材的可行性。
　　方法：1）采用全式金試劑盒、天根試劑盒、CTAB法對(duì)市售鹿茸切片和蜈蚣藥材進(jìn)行DNA提取，通過(guò)核酸蛋白定量?jī)x、電泳凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)，確定適宜的提取方法；2）用COⅠ通用引物對(duì)市售鹿茸切片、蜈蚣干品提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，觀察擴(kuò)增

2、結(jié)果，并用TA克隆方法對(duì)鹿茸切片PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆純化，將鹿茸切片純化后的質(zhì)粒、菌液和蜈蚣PCR切膠回收的產(chǎn)物使用核酸測(cè)序儀ABI3730XL進(jìn)行測(cè)序；3）將得到的序列在GenBank中進(jìn)行相似檢索，下載需要序列，利用DNAMAN軟件、MEGA6.06分子進(jìn)化遺傳分析等軟件對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行排序比對(duì)、計(jì)算GC含量，采用K-2p計(jì)算遺傳距離，用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)；4）在蜈蚣正品原動(dòng)物及其混偽品原動(dòng)物中藥材的COⅠ基因全序列分析的基礎(chǔ)

3、上，設(shè)計(jì)一對(duì)專(zhuān)用于鑒定蜈蚣干品藥材的位點(diǎn)特異性鑒別引物，用鑒別引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，觀察其陰陽(yáng)性結(jié)果。
　　結(jié)果：1）經(jīng)過(guò)兩種試劑盒和CTAB法提取DNA基因組的比較，先使用天根試劑盒進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)提取的DNA純度較高，當(dāng)天根試劑盒無(wú)法達(dá)到提取的濃度要求時(shí)便可采用CTAB法，而CTAB法提取的DNA濃度較高，為干品藥材的DNA提取提供了保障；2）線粒體COⅠ通用引物對(duì)市售鹿茸切片和蜈蚣提取的DNA基因組擴(kuò)增良好，目的條帶明亮，

4、但隱約可見(jiàn)非目的性條帶存在；采用TA克隆方法的確可以彌補(bǔ)前期提取DNA純度不高的不足之處；鹿茸切片和蜈蚣COⅠ序列單一，幾乎無(wú)雜峰干擾，測(cè)序成功；3）在NCBI中進(jìn)行BLAST后，可以初步確定采集的鹿茸切片樣品5號(hào)、8號(hào)、3-a為偽品，采集的蜈蚣干品藥材均為正品；根據(jù)系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)發(fā)現(xiàn)鹿茸切片樣品5號(hào)、8號(hào)樣本與馴鹿聚在一支，3-a樣本能夠單獨(dú)為一支，兩種正品藥材同屬聚在一起，個(gè)別物種又形成相對(duì)獨(dú)立的一支，支持率≧50，聚類(lèi)樹(shù)的情況與BLA

5、ST結(jié)果一致；4）使用Primer軟件設(shè)計(jì)的針對(duì)蜈蚣COⅠ序列的特異性引物能夠?qū)⑹惺垓隍颊齻纹愤M(jìn)行鑒別，根據(jù)PCR擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果表明正品蜈蚣均出現(xiàn)了單一明亮條帶，而偽品蜈蚣則沒(méi)有明亮條帶。
　　結(jié)論：1）使用天根試劑盒和CTAB法進(jìn)行鹿茸切片和蜈蚣干品的DNA提取是切實(shí)可行的，為同類(lèi)市售藥材的DNA提取提供了方法參考依據(jù)；2）直接對(duì)市售鹿茸切片和蜈蚣干品使用COⅠ序列的DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行真?zhèn)舞b別是可行的，可以在市售動(dòng)物藥材的鑒

6、別中進(jìn)行推廣使用，為以往對(duì)動(dòng)物藥材鑒定研究材料選擇上提供了新的選擇，節(jié)約了以往采集、保存、運(yùn)輸基源動(dòng)物組織或血液等材料的人力、物力、財(cái)力成本，凸顯了采用市售藥材為研究對(duì)象的便捷性、直觀性；使用TA克隆方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，可以彌補(bǔ)在DNA提取過(guò)程DNA純度不高的不足；3）使用該特異性引物 WG-F‘CGGTCCAGCATGAGTAATATTTGA’，WG-R‘AGGAAGTTTAATC GGAGATGAT’可以鑒別市售的蜈蚣藥材，提