丹參酮IIA磺酸鈉通過PKG-PPARγ-TRPC信號通路抑制缺氧誘導肺動脈平滑肌細胞SOCE的上調.pdf

1、【研究背景】肺動脈高壓（PAH）是一類以海平面靜息狀態(tài)下，肺動脈平均壓（mPAP）≥25mmHg（右心導管下）為血流動力學診斷標準的疾病。它是一種可伴隨多種臨床癥狀并能導致嚴重心肺功能障礙，最終致患者死亡的臨床綜合征，其主要臨床病理生理特點為肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）異常增殖、血管重構導致肺動脈壓持續(xù)性、漸進性增高。近年來靶向藥物的出現及其廣泛使用給廣大肺動脈高壓患者帶來了福音，然而價格的高昂及較多副作用大大地限制其治療。因此，尋

2、找肺動脈高壓新靶點及新型藥物顯得尤為重要。我們和其他課題組以往的研究發(fā)現丹參酮IIA磺酸鈉（STS）可通過抑制經典瞬時受體蛋白1，6（TRPC）的表達從而調節(jié)PASMCs中的鈣穩(wěn)態(tài)，進而有效降低慢性低氧性肺動脈高壓（CHPH）大鼠模型及野百合堿（MCT）致肺動脈高壓大鼠模型的mPAP及其血管重塑。除此之外，研究還發(fā)現了STS可有效治療肺動脈高壓患者。然而， STS通過何種途徑對PASMCs中基礎鈣(basal[Ca2+]i)及鈣池操縱性

3、鈣內流（SOCE）進行調控仍需要進一步研究。已有文獻證實蛋白激酶G（PKG）/過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)通路參與調節(jié)PASMCs中TRPC1，6蛋白的表達，進而影響basal[Ca2+]i和SOCE，并最終導致PASMCs的過度增殖，肺血管重塑。在此基礎上，提出了研究假設：STS通過PKG/PPARγ/TRPC信號通路，從而對PASMCs中的鈣穩(wěn)態(tài)進行調節(jié)。
　　【研究目的】本研究運用CHPH大鼠動物模型驗證STS

4、對肺動脈高壓的治療作用；運用大鼠遠端 PASMCs原代培養(yǎng)模型及 CHPH大鼠動物模型觀察 STS干預對PASMCs及肺動脈平滑肌組織（PA）中PKG、PPARγ蛋白表達的影響；運用PKG抑制劑（RP-8）及PPARγ抑制劑(T0070907),觀察STS對PASMCs中TRPC1、TRPC6蛋白表達、[Ca2+]i及SOCE的影響；構建PKG及PPARγ特異性小分子干擾RNA（siRNA）沉默PKG及PPARγ表達，觀察 STS對 P

5、ASMCs中 TRPC1、TRPC6蛋白表達、[Ca2+]i及SOCE的影響；通過 MTT實驗，觀察 PKG抑制劑（RP-8）及 PPARγ激動劑(GW1929)、抑制劑(T0070907)是否影響STS在缺氧狀態(tài)下對PASMCs增殖的抑制。從而探討 STS參與 PASMCs中鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)的機制是否通過PKG/PPARγ/TRPC信號通路，為STS防治肺動脈高壓疾病提供堅實的理論基礎并尋找更有效靶點。
　　【研究方法】
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6、.建立慢性低氧性肺動脈高壓大鼠模型：（1）運用小動物生理儀檢測STS刺激對右心室收縮壓（RVSP）、平均右心室壓（mRVP）和右心肥厚指數（RV/(LV+S)）的作用；（2）利用蘇木精和伊紅（HE）染色觀察STS刺激對肺血管重塑的影響；（3）利用Western blotting技術測定STS刺激對PA中PKG、PPARγ蛋白表達產生的影響。
　　2.建立原代肺動脈平滑肌細胞模型：（1）利用InCyte細胞內鈣濃度檢測系統(tǒng)，檢測ST

7、S及RP-8或GW1929或T0070907聯合刺激對大鼠PASMCs的基礎[Ca2+]i和SOCE的影響；（2）應用Western blotting檢測STS刺激對大鼠遠端PASMCs中PKG、PPARγ蛋白表達產生的影響，在此基礎上觀察STS及RP-8或GW1929或T0070907聯合刺激對大鼠遠端PASMCs中 TRPC1、TRPC6蛋白表達的影響；（3）構建并轉染特異性的siR-PKG及siR-PPARγ到PASMCs,利用I

8、nCyte細胞內鈣濃度檢測系統(tǒng)檢測STS刺激對大鼠PASMCs的基礎[Ca2+]i和SOCE的影響并運用Western blotting檢測STS刺激對大鼠遠端PASMCs中TRPC1、TRPC6蛋白表達產生的影響；（4）利用MTT實驗,觀察STS及RP-8或GW1929或T0070907聯合刺激對大鼠遠端PASMCs增殖的影響。
　　【實驗結果】
　　1、腹腔注射 STS（30mg/kg.d）治療可降低慢性低氧性肺動脈高壓

9、大鼠模型中的RVSP、mRVP和RV/(LV+S)，逆轉模型組大鼠的血管重塑。
　　2、STS（30mg/kg.d）干預治療可上調CHPH大鼠肺動脈平滑肌組織PKG及PPARγ蛋白表達，且STS（12.5μM,60h）刺激可升高原代培養(yǎng)的大鼠遠端PASMCs中PKG及PPARγ蛋白表達。
　　3、缺氧狀態(tài)下，PKG抑制劑RP-8(1μM,60h)刺激可逆轉STS對大鼠遠端PASMCs中PPARγ蛋白的上調及對TRPC1、TR

10、PC6蛋白的下調效應；而PPARγ拮抗劑T0070907(10μM,60h)刺激可抑制STS對大鼠遠端PASMCs中TRPC1、TRPC6蛋白的下調作用。
　　4、缺氧狀態(tài)下，特異性 PKG siRNA可抑制 STS對大鼠遠端 PASMCs中PPARγ蛋白的上調及TRPC1、TRPC6蛋白的下調作用；而siR-PPARγ則可逆轉STS對的大鼠遠端PASMCs中TRPC1、TRPC6蛋白表達的下調作用。
　　5、PKG抑制劑R

11、P-8(1μM,60h)或PPARγ拮抗劑T0070907(10μM,60h)刺激可以抑制缺氧狀態(tài)下STS對的基礎鈣和SOCE的下調效應；相反，PPARγ的激動劑GW1929(10μM,60h)則可促進STS對基礎鈣和SOCE的下調效應。
　　6、缺氧狀態(tài)下，PKG抑制劑RP-8(1μM,60h)或PPARγ拮抗劑T0070907(10μM,60h)均可抑制STS對大鼠遠端PASMCs細胞增殖的抑制作用，而PPARγ的激動劑GW1