丹參酮ⅡA磺酸鈉通過(guò)GLUT1-LRP1-Aβ改善APP-PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知障礙.pdf

1、目的:
　　阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種慢性、進(jìn)行性的神經(jīng)變性過(guò)程，其特征在于由細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外積累的β-淀粉樣蛋白(Aβ)和高度磷酸化的tau纖維蛋白引起的病理過(guò)程，這些聚集體的過(guò)度積聚最終將導(dǎo)致突觸功能障礙及隨后的神經(jīng)元損失。至今關(guān)于AD精確的分子機(jī)制尚未完全明確，但很明顯，AD是一種復(fù)雜的多因素導(dǎo)致的疾病。AD不僅給患者的身心健康帶來(lái)嚴(yán)重的危害，并給社會(huì)和家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理負(fù)擔(dān)。

2、然而迄今為止，仍然缺乏有效的治療手段可以治愈AD。因此，加強(qiáng)AD的精確的分子機(jī)制的研究、尋找持久有效的防治AD的新藥，對(duì)于改善AD患者的心理生理狀態(tài)及生活質(zhì)量，減輕家庭負(fù)擔(dān)，緩解社會(huì)壓力具有重要意義。
　　目前AD的病因和發(fā)病機(jī)制存在多種假說(shuō)，其中“淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)”已被大多數(shù)研究學(xué)者所廣泛接受。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為各種原因?qū)е翧β代謝異常，包括Aβ的生成增多、降解或清除轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，導(dǎo)致其在腦內(nèi)異常增多并不斷聚集沉積，從而觸發(fā)了與AD相關(guān)的

3、一系列下游的病理生理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、膽堿能系統(tǒng)改變、tau蛋白過(guò)度磷酸化、突觸功能障礙、膠質(zhì)細(xì)胞活化誘發(fā)的炎癥反應(yīng)、離子穩(wěn)態(tài)失衡等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷丟失并引起癡呆。因此，Aβ被堅(jiān)定的認(rèn)為是AD發(fā)病的始發(fā)因素。
　　丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA，TanⅡA)是丹參中主要的活性成分之一。許多研究表明，TanⅡA具有抗自由基、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)保護(hù)、改善癡呆動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶能力等作用。但TanⅡA由于水溶性

4、差、生物利用度低，很大程度的限制了它的使用。丹參酮ⅡA磺酸鈉(Sodium TanshinoneⅡA Sulfonate，STS)即在TanⅡA的化學(xué)結(jié)構(gòu)上引入磺酸鈉基團(tuán)，從而增強(qiáng)了藥物的水溶性，也提高了其生物利用度和療效。本研究以APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為動(dòng)物模型，探討STS對(duì)AD的治療作用及其可能的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.化學(xué)實(shí)驗(yàn)
　　(1) ThT熒光檢測(cè)STS抑制Aβ單體聚集的作用。
　　(2)

5、 ThT熒光檢測(cè)STS促進(jìn)Aβ成熟纖維解聚的作用。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　(1) STS改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知障礙:12月齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(0.9％ NaCl)、STS低劑量組(10 mg/kg)、STS高劑量組(20 mg/kg)，性別和年齡匹配的同窩野生型小鼠作為正常對(duì)照組(0.9％ NaCl)和陰性對(duì)照組(STS20 mg/kg)，每組10只，腹腔注射給藥，每日1次，共2個(gè)月

6、。采用Morris水迷宮、Y迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。
　　(2)STS對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)β樣淀粉蛋白的影響:硫磺素染色法檢測(cè)小鼠腦內(nèi)淀粉樣斑塊沉積狀況。
　　(3) STS對(duì)Aβ級(jí)聯(lián)反應(yīng)的影響:氧化應(yīng)激水平檢測(cè)指標(biāo):活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD);膽堿能系統(tǒng)檢測(cè)指標(biāo):乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(CHAT)、乙酰膽堿酯酶(AChE);Western blotting檢測(cè)突觸相關(guān)蛋白P

7、SD93、PSD95、Synaptophysin表達(dá)水平;Western blotting檢測(cè)神經(jīng)保護(hù)因子BDNF、NGF表達(dá)水平。
　　(4) STS對(duì)Aβ生成、降解、轉(zhuǎn)運(yùn)的影響:Western blotting檢測(cè)Aβ生成、降解、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白App、sApp-α、sApp-β、ADAM10、BACE1、PS1、NEP、IDE、LRP1、RAGE、GLUT1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.STS能夠明顯降低Aβ單體

8、聚集的熒光強(qiáng)度，提示STS能夠抑制Aβ單體轉(zhuǎn)化為Aβ纖維，即具有抑制Aβ單體聚集的能力。趨勢(shì)檢驗(yàn)提示隨著STS濃度的升高，這種抑制能力也隨之增強(qiáng)，即STS抑制Aβ單體聚集的能力具有顯著的劑量依賴特性。
　　2.STS能夠降低已形成纖維的Aβ的熒光強(qiáng)度，即具有促進(jìn)Aβ纖維解聚的能力。趨勢(shì)檢驗(yàn)提示隨著STS濃度的升高，這種促進(jìn)能力越強(qiáng)，即STS促進(jìn)Aβ纖維解聚的能力具有顯著的劑量依賴特性。
　　3.STS能夠改善12月齡APP/

9、PS1轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知障礙:小鼠在Morris水迷宮檢測(cè)中，STS用藥組與對(duì)照組相比，逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間增長(zhǎng);Y迷宮檢測(cè)中，STS用藥組與對(duì)照組相比，自發(fā)交替率增高，新臂停留時(shí)間加長(zhǎng)。均表明小鼠的記憶功能得到了改善。
　　4.STS能夠減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)淀粉樣斑塊沉積。
　　5.STS對(duì)Aβ級(jí)聯(lián)反應(yīng)的影響:小鼠經(jīng)藥物治療后，STS用藥組與對(duì)照組相比，氧化應(yīng)激水平降低;膽堿能系

10、統(tǒng)功能得到改善;突觸功能損傷得到修復(fù)。
　　6.STS對(duì)Aβ生成、降解、轉(zhuǎn)運(yùn)的影響:STS對(duì)Aβ生成及降解相關(guān)蛋白ADAM10、BACE1、PS1、NEP、IDE無(wú)影響，說(shuō)明STS對(duì)Aβ的生成和降解無(wú)影響;STS能促進(jìn)Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白LRP1的表達(dá)，但是對(duì)RAGE沒(méi)有影響;且STS能夠促進(jìn)GLUT1的表達(dá)，推測(cè)STS通過(guò)促進(jìn)GLUT1表達(dá)進(jìn)而增加LRP1對(duì)Aβ的由腦向血液的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　結(jié)論:
　　在體外STS能抑制Aβ