葉酸介導(dǎo)的石墨烯-磁納米粒的合成及體外抗腫瘤靶向性評(píng)價(jià).pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，已成為威脅人類健康的主要病因之一。傳統(tǒng)的抗腫瘤治療方法因缺乏靶向性而達(dá)不到預(yù)期的效果。近年來(lái)，采用針對(duì)惡性腫瘤特異標(biāo)記物的分子靶向治療越來(lái)越受到人們的關(guān)注和認(rèn)可，其中，最受關(guān)注的是將葉酸作為靶向分子，對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體進(jìn)行特異性靶向。本研究以石墨烯為載體，共軛結(jié)合葉酸，然后物理吸附磁納米顆粒(Fe3O4)，形成一個(gè)既可用于靶向癌細(xì)胞輸送，又可用于MRI成像的新型納米載體系

2、統(tǒng)，有望在腫瘤的靶向診斷與治療中實(shí)現(xiàn)新的突破。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　本課題采用石墨粉與聚乙烯亞胺(PEI)共混球磨的方法制備了氨基功能化石墨烯(PEI-G)，然后通過(guò)PEI-G的氨基與葉酸的羧基共價(jià)鍵反應(yīng)形成酰胺鍵，制備了葉酸-石墨烯復(fù)合材料(FA-PEI-G)。最后通過(guò)分子間作用力物理吸附Fe3O4，制備了葉酸介導(dǎo)的FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料。采用拉曼光譜、紫外吸收光譜、傅里葉紅外光譜、X射線衍射、X射線光電子能

3、譜分析等方法對(duì)FA-PEI-G/Fe3O4進(jìn)行理化性能表征。選取了人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB)和人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞(OCM-1)探討了FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞的毒性以及靶向性。其中，本研究采用熒光定量PCR和免疫熒光法等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了KB、OCM-1細(xì)胞葉酸受體的表達(dá)量;采用CCK-8、乳酸脫氫酶試劑盒(LDH)、ROS試劑盒鑒定了FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料對(duì)KB、OCM-1細(xì)胞的生物相容性;通過(guò)普魯士藍(lán)染色和

4、透射電子顯微鏡觀察的方法，確定了FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料對(duì)KB、OCM-1細(xì)胞的靶向性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.氨基功能化石墨烯(PEI-G)的表征結(jié)果
　　原子力顯微鏡(AFM)與透射電子顯微鏡(TEM)表征結(jié)果證明通過(guò)球磨法制備的石墨烯納米片層厚度在1～2nm。Raman、UV、FTIR、XPS等表征表明制備的氨基功能化石墨烯同時(shí)具有石墨烯與聚乙烯亞胺的特征峰。
　　2.葉酸-石墨烯/Fe3O4

5、復(fù)合材料(FA-PEI-G/Fe3O4)的表征結(jié)果
　　通過(guò)UV、FTIR的表征結(jié)果表明通過(guò)酰胺化反應(yīng)制備的葉酸-石墨烯納米材料同時(shí)具有葉酸和PEI-G的特征峰，XRD、TEM、磁滯曲線等表征結(jié)果證明FA-PEI-G納米材料通過(guò)分子間作用力吸附了Fe3O4，成功制備了葉酸介導(dǎo)的石墨烯/Fe3O4復(fù)合材料(FA-PEI-G/Fe3O4)。
　　3.細(xì)胞表面葉酸表達(dá)量鑒定及細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果
　　(1)熒光定量PCR和免疫熒

6、光結(jié)果顯示KB細(xì)胞表面葉酸受體表達(dá)量很高，而OCM-1細(xì)胞表面幾乎沒(méi)有葉酸受體蛋白表達(dá)。
　　(2)CCK-8、ROS、LDH分析實(shí)驗(yàn)均表明FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料對(duì)KB、OCM-1細(xì)胞展現(xiàn)出良好的生物相容性。其中，CCK-8的結(jié)果表明FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料在濃度為200μg/ml時(shí)，細(xì)胞的存活率依然在100％左右，跟對(duì)照組相差不大。ROS，LDH釋放量相對(duì)于對(duì)照組也都比較低。
　　4.葉酸-石墨烯

7、/Fe3O4復(fù)合材料(FA-PEI-G/Fe3O4)的靶向性鑒定
　　采用普魯士藍(lán)染色和透射電子顯微鏡(TEM)觀察的方法顯示部分FA-PEI-G/Fe3O4進(jìn)入了KB細(xì)胞，且隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加;只有少量FA-PEI-G/Fe3O4進(jìn)入了OCM-1細(xì)胞，并且不隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。透射電鏡(TEM)同時(shí)顯示FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料雖然進(jìn)入了細(xì)胞但并沒(méi)有損傷細(xì)胞，與上述細(xì)胞毒性檢測(cè)的結(jié)果一致。
　　

8、實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　本論文采用了新型的廉價(jià)、簡(jiǎn)單、安全的邊緣功能化球磨法制備了氨基功能化的石墨烯(PEI-G)，通過(guò)共價(jià)鍵作用將葉酸固定在PEI-G，最后通過(guò)物理吸附在納米材料表面引入磁納米粒子Fe3O4，用于高靶向的抗腫瘤載藥體系FA-PEI-G/Fe3O4。所合成的復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞呈現(xiàn)出良好的生物相容性，而且對(duì)葉酸受體高表達(dá)的KB細(xì)胞具有特異靶向性，對(duì)葉酸受體不表達(dá)的OCM-1細(xì)胞不具有靶向性。研究結(jié)果表明FA-PEI-G/Fe3O