葉酸介導(dǎo)的石墨烯-磁納米粒的合成及體外抗腫瘤靶向性評價.pdf

1、實驗?zāi)康?
　　惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，已成為威脅人類健康的主要病因之一。傳統(tǒng)的抗腫瘤治療方法因缺乏靶向性而達不到預(yù)期的效果。近年來，采用針對惡性腫瘤特異標(biāo)記物的分子靶向治療越來越受到人們的關(guān)注和認(rèn)可，其中，最受關(guān)注的是將葉酸作為靶向分子，對腫瘤細(xì)胞表面的葉酸受體進行特異性靶向。本研究以石墨烯為載體，共軛結(jié)合葉酸，然后物理吸附磁納米顆粒(Fe3O4)，形成一個既可用于靶向癌細(xì)胞輸送，又可用于MRI成像的新型納米載體系

2、統(tǒng)，有望在腫瘤的靶向診斷與治療中實現(xiàn)新的突破。
　　實驗方法:
　　本課題采用石墨粉與聚乙烯亞胺(PEI)共混球磨的方法制備了氨基功能化石墨烯(PEI-G)，然后通過PEI-G的氨基與葉酸的羧基共價鍵反應(yīng)形成酰胺鍵，制備了葉酸-石墨烯復(fù)合材料(FA-PEI-G)。最后通過分子間作用力物理吸附Fe3O4，制備了葉酸介導(dǎo)的FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料。采用拉曼光譜、紫外吸收光譜、傅里葉紅外光譜、X射線衍射、X射線光電子能

3、譜分析等方法對FA-PEI-G/Fe3O4進行理化性能表征。選取了人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB)和人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞(OCM-1)探討了FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料對細(xì)胞的毒性以及靶向性。其中，本研究采用熒光定量PCR和免疫熒光法等實驗檢測了KB、OCM-1細(xì)胞葉酸受體的表達量;采用CCK-8、乳酸脫氫酶試劑盒(LDH)、ROS試劑盒鑒定了FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料對KB、OCM-1細(xì)胞的生物相容性;通過普魯士藍(lán)染色和

4、透射電子顯微鏡觀察的方法，確定了FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料對KB、OCM-1細(xì)胞的靶向性。
　　實驗結(jié)果:
　　1.氨基功能化石墨烯(PEI-G)的表征結(jié)果
　　原子力顯微鏡(AFM)與透射電子顯微鏡(TEM)表征結(jié)果證明通過球磨法制備的石墨烯納米片層厚度在1～2nm。Raman、UV、FTIR、XPS等表征表明制備的氨基功能化石墨烯同時具有石墨烯與聚乙烯亞胺的特征峰。
　　2.葉酸-石墨烯/Fe3O4

5、復(fù)合材料(FA-PEI-G/Fe3O4)的表征結(jié)果
　　通過UV、FTIR的表征結(jié)果表明通過酰胺化反應(yīng)制備的葉酸-石墨烯納米材料同時具有葉酸和PEI-G的特征峰，XRD、TEM、磁滯曲線等表征結(jié)果證明FA-PEI-G納米材料通過分子間作用力吸附了Fe3O4，成功制備了葉酸介導(dǎo)的石墨烯/Fe3O4復(fù)合材料(FA-PEI-G/Fe3O4)。
　　3.細(xì)胞表面葉酸表達量鑒定及細(xì)胞毒性檢測結(jié)果
　　(1)熒光定量PCR和免疫熒

6、光結(jié)果顯示KB細(xì)胞表面葉酸受體表達量很高，而OCM-1細(xì)胞表面幾乎沒有葉酸受體蛋白表達。
　　(2)CCK-8、ROS、LDH分析實驗均表明FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料對KB、OCM-1細(xì)胞展現(xiàn)出良好的生物相容性。其中，CCK-8的結(jié)果表明FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料在濃度為200μg/ml時，細(xì)胞的存活率依然在100％左右，跟對照組相差不大。ROS，LDH釋放量相對于對照組也都比較低。
　　4.葉酸-石墨烯

7、/Fe3O4復(fù)合材料(FA-PEI-G/Fe3O4)的靶向性鑒定
　　采用普魯士藍(lán)染色和透射電子顯微鏡(TEM)觀察的方法顯示部分FA-PEI-G/Fe3O4進入了KB細(xì)胞，且隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間的延長而增加;只有少量FA-PEI-G/Fe3O4進入了OCM-1細(xì)胞，并且不隨細(xì)胞培養(yǎng)時間的延長而增加。透射電鏡(TEM)同時顯示FA-PEI-G/Fe3O4復(fù)合材料雖然進入了細(xì)胞但并沒有損傷細(xì)胞，與上述細(xì)胞毒性檢測的結(jié)果一致。
　　

8、實驗結(jié)論:
　　本論文采用了新型的廉價、簡單、安全的邊緣功能化球磨法制備了氨基功能化的石墨烯(PEI-G)，通過共價鍵作用將葉酸固定在PEI-G，最后通過物理吸附在納米材料表面引入磁納米粒子Fe3O4，用于高靶向的抗腫瘤載藥體系FA-PEI-G/Fe3O4。所合成的復(fù)合材料對細(xì)胞呈現(xiàn)出良好的生物相容性，而且對葉酸受體高表達的KB細(xì)胞具有特異靶向性，對葉酸受體不表達的OCM-1細(xì)胞不具有靶向性。研究結(jié)果表明FA-PEI-G/Fe3O