基因檢測(cè)和點(diǎn)突變識(shí)別的DNA探針及適配體生物傳感新方法研究.pdf

1、隨著人類基因組計(jì)劃的完成和功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展，建立簡(jiǎn)單、靈敏、快速、特異性強(qiáng)、高通量的蛋白質(zhì)和基因檢測(cè)方法，已成為分析科學(xué)家們研究的重點(diǎn)之一。核酸堿基的突變與人類許多疾病有著直接的關(guān)系，因此實(shí)現(xiàn)單核苷酸突變準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)對(duì)疾病的早期診斷也有著重要的意義。核酸適配體是近年來發(fā)展起來的一類經(jīng)體外人工進(jìn)化程序篩選出的寡聚核苷酸。 由于其不但和抗體一樣能與配體高效、特異性地結(jié)合，而且具有許多抗體無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，因此將核酸適配體應(yīng)

2、用于生物傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)包括蛋白質(zhì)、小分子等目標(biāo)物的檢測(cè)有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?鑒于電化學(xué)及壓電檢測(cè)技術(shù)所需儀器簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、易于實(shí)現(xiàn)微型化，且靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)，本研究論文針對(duì)當(dāng)前傳感器設(shè)計(jì)中的探針固定化和檢測(cè)方法兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)，在電化學(xué)及壓電DNA傳感器用于基因檢測(cè)和點(diǎn)突變識(shí)別以及電化學(xué)適配體傳感器兩方面開展了一些新方法研究工作。具體內(nèi)容如下： (1)在第2章中，研制出一種新型的基于納米多孔CeO2/殼聚糖復(fù)合膜的固定

3、基質(zhì)。用它來固定單鏈DNA探針，構(gòu)建了檢測(cè)與結(jié)腸癌高度相關(guān)的基因序列的電化學(xué)DNA生物傳感器。該固定基質(zhì)制備方法簡(jiǎn)單，成本低，結(jié)合了CeO2和殼聚糖的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的生物兼容性，無毒性和優(yōu)越的電子傳導(dǎo)性。將其用于固定結(jié)腸癌基因的互補(bǔ)探針序列，能夠顯著增強(qiáng)ssDNA探針在電極表面的負(fù)載量。制得的傳感器檢測(cè)目標(biāo)的線性范圍在1.6×10-11-1.2×10-7M，檢測(cè)下限為1.0×10-11 M，具有識(shí)別完全互補(bǔ)目標(biāo)序列和四堿基錯(cuò)配序列的能力

4、。 (2)在第3章中，基于連接酶的高保真性和生物催化沉積反應(yīng)，提出了用于高特異性識(shí)別單堿基突變的壓電檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)中，目標(biāo)DNA鏈先與連接在石英晶振上的DNA捕獲探針雜交，再與生物素標(biāo)記的等位特異性DNA檢測(cè)探針雜交。只有在目標(biāo)DNA鏈和檢測(cè)探針完全匹配時(shí)，連接反應(yīng)才能發(fā)生，即將捕獲探針和檢測(cè)探針相連接。否則，即使只有一個(gè)等位錯(cuò)配的基因，連接反應(yīng)也不會(huì)發(fā)生。經(jīng)過高溫?zé)崽幚?，形成的雙鏈解開，只有與目標(biāo)鏈完全匹配的檢測(cè)探針保留在電

5、極表面。生物素化的檢測(cè)探針繼而與鏈酶親和素化的辣根過氧化物(SA-HRP)綁定，辣根過氧化物催化過氧化氫氧化底物中的3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)在電極表面生成不溶性沉淀物，使壓電頻率響應(yīng)顯著增大。用該方法對(duì)β-地中海貧血基因-28位密碼子的突變情況進(jìn)行了檢測(cè)，使突變型和野生型得到了很好的區(qū)分，對(duì)目標(biāo)的檢測(cè)線性范圍為0.7-100 nM，檢測(cè)下限達(dá)0.1 nM，是一個(gè)低成本高效率的檢測(cè)方法。 (3)在第4章中，基于等位基因特異

6、性延伸法，結(jié)合酶催化銀沉積的放大體系，提出了用于單堿基突變的電化學(xué)檢測(cè)方法。首先，在金電極表面固定的等位特異性捕獲探針。由于其與野生型目標(biāo)鏈完全互補(bǔ)，在聚合酶的作用下能夠發(fā)生延伸反應(yīng)；而突變型目標(biāo)鏈由于3’端與捕獲探針發(fā)生錯(cuò)配，延伸反應(yīng)不能進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)突變型和野生型基因的區(qū)分。用1 M NaOH進(jìn)行解鏈處理后，雙鏈結(jié)構(gòu)解開，目標(biāo)鏈從電極表面脫落。在電極表面滴加與探針延伸部分相互補(bǔ)的生物素化的檢測(cè)探針后，只有發(fā)生延伸反應(yīng)的捕獲探針鏈會(huì)

7、進(jìn)一步與生物素化的檢測(cè)探針雜交，并引入鏈親和素化的堿性磷酸酶，繼而發(fā)生酶催化沉積銀的反應(yīng)。通過線性掃描伏安法可以檢測(cè)出電極表面沉積的銀。該方法成功用于β-地中海貧血基因-28位密碼子單堿基突變的區(qū)分和定量檢測(cè)，簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，線性范圍為3.0×10-16-3.0×10-8M，檢測(cè)下限為1.0×10-16M。 (4)在第5章中，報(bào)道了基于目標(biāo)物誘導(dǎo)置換適配體的無標(biāo)記電化學(xué)傳感器，用于以腺苷為分析物模型的目標(biāo)物檢測(cè)。該傳感器

8、使用1，6-巰基己醇自組裝層修飾的金電極為傳感基底，以巰基己醇為媒介組裝金納米顆粒層，能夠增加巰基捕獲探針的表面負(fù)載量，提高信號(hào)強(qiáng)度。含有腺苷適配體序列的一段寡核苷酸序列一部分可與捕獲探針雜交，在電極表面形成捕獲探針與適配體的雙鏈復(fù)合物。含有腺苷的分析物的加入，把腺苷適配體序列置換下來，使其從電極表面解離，從而減少了電極表面核酸鏈的數(shù)量，使與核酸作用的電化學(xué)活性指示劑亞甲基藍(lán)的量相應(yīng)減少。指示劑的還原電流的大小能夠反映被分析物的濃度。構(gòu)

9、造的傳感器簡(jiǎn)單、快速、靈敏、選擇性好，線形范圍為5.1000 nM，檢測(cè)下限為1 nM，同時(shí)具有簡(jiǎn)便快速的再生能力。 (5)在第6章中，報(bào)道了基于抗體與生物素標(biāo)記的適配體新型夾心的酶放大電化學(xué)免疫傳感器，用于免疫球蛋白E(IgE)的檢測(cè)。IgE多克隆抗體作為捕獲探針通過半胱胺自組裝層以及交聯(lián)劑戊二醛的作用共價(jià)固定在金電極表面，與目標(biāo)物發(fā)生免疫反應(yīng)后，繼續(xù)捕獲生物素化的IgE適配體的檢測(cè)探針，從而形成一種新型的夾心結(jié)構(gòu)。之后，通

10、過生物素與親和素的特異性親和作用，親和素標(biāo)記的堿性磷酸酯酶能與電極表面適配體上的生物素相結(jié)合，促使堿性磷酸酯酶催化底物抗壞血酸磷酸酯水解成強(qiáng)還原劑抗壞血酸，并將底液中的銀離子還原成單質(zhì)銀，沉積到電極表面。沉積的銀的量與電極表面捕獲的目標(biāo)IgE的量成正比，可以用溶出伏安法來定量。結(jié)果表明，該免疫傳感器結(jié)合了抗體和適配體的雙重特異性，并利用了酶催化銀沉積體系的高靈敏性，檢測(cè)目標(biāo)蛋白的靈敏度高、特異性好，線性范圍為0.1-100 nM，檢測(cè)下

11、限為0.02 nM。 (6)第7章，同樣基于抗體與適配體的新型夾心結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了納米金/殼聚糖電化學(xué)沉積復(fù)合膜的新型固定基質(zhì)用于抗體的固定，采用亞甲基藍(lán)為電活性指示劑，報(bào)道了檢測(cè)凝血酶的無標(biāo)記電化學(xué)方法。該復(fù)合膜結(jié)合了納米金和殼聚糖獨(dú)特的性能，提高了傳感器的導(dǎo)電性能以及負(fù)載量。實(shí)驗(yàn)考察了納米金/殼聚糖電化學(xué)沉積條件，并用掃描電子顯微鏡對(duì)該膜進(jìn)行了表征。 在這個(gè)工作中，在不改變適配體與目標(biāo)物結(jié)合作用的基礎(chǔ)上，對(duì)原凝血酶的