基于DNA模板化銅納米簇的生物分子檢測新方法研究.pdf

1、近年來，金屬納米簇作為一種新興的納米材料得到了廣泛的研究及應用。與有機熒光染料等傳統(tǒng)熒光探針相比，金屬納米簇顯示出更優(yōu)越的熒光特性，如良好的生物相容性、較強的光穩(wěn)定性以及較高的熒光量子產率等，在熒光傳感和生物成像領域顯現出廣闊的應用前景。本文圍繞DNA模板化的銅納米簇在生物傳感領域的應用，主要開展了以下工作：
　　首先，本論文設計了一種啞鈴型雙鏈DNA探針作為合成銅納米簇的模板，同時利用E.Coli DNA連接酶對輔酶Ⅰ的高度依賴

2、性，并結合Klenow Fragment聚合酶的聚合延伸作用，發(fā)展了一種免標檢測輔酶Ⅰ的熒光分析新方法。啞鈴型探針通過Klenow Fragment聚合酶的聚合延伸作用可以產生更長的雙鏈DNA銅簇模板，從而使體系熒光信號大大增強。當E.Coli DNA連接酶被輔酶Ⅰ激活后，啞鈴型DNA探針相鄰的5'端磷酸基團和3'端羥基被連接起來形成一個封閉的“啞鈴”結構，體系熒光信號無法得到增強。這個方法比較靈敏，檢測限達到了0.2 nM，并且在復雜

3、的生物體系中也實現了對輔酶Ⅰ活性的分析。
　　接下來，本論文基于富T堿基單鏈DNA模板化的銅納米簇和T4多聚核苷酸激酶的3'端去磷酸化活性，結合Klenow Fragment聚合酶的延伸作用，提出了一種免標分析T4多聚核苷酸激酶及其抑制劑活性的熒光方法。由于T4多聚核苷酸激酶能夠催化DNA的3'端發(fā)生去磷酸化反應，所以探針3'端的磷酸基團被水解為羥基，再通過Klenow Fragment聚合酶的聚合延伸反應生成與富T堿基互補的雙鏈

4、DNA結構，致使富T堿基序列由于雙鏈化而不能作為模板合成銅納米簇。當不存在T4多聚核苷酸激酶時，3'端磷酸化修飾的探針無法發(fā)生聚合延伸反應產生雙鏈結構，可利用富T堿基DNA單鏈合成銅納米簇，體系產生較強的熒光信號。這種方法選擇性很高，檢測限達到了0.25 U/mL，同時還能實現復雜生物環(huán)境中T4多聚核苷酸激酶活性的分析檢測。
　　最后，本論文基于富T堿基環(huán)狀DNA探針為模板合成的銅納米簇設計了一種簡單、靈敏、成本低、免標檢測核酸外