蝎毒多肽提取物增強(qiáng)自噬作用抑制H22肝癌移植瘤生長(zhǎng)的研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)觀察蝎毒多肽提取物（PESV）及聯(lián)合化療干預(yù)小鼠H22肝癌移植瘤自噬相關(guān)蛋白及血管生成相關(guān)通路蛋白表達(dá)和腫瘤血管密度的變化，明確PESV和聯(lián)合化療對(duì)腫瘤自噬的影響和抗血管生成作用，探討PESV聯(lián)合雷帕霉素通過(guò)腫瘤自噬抑制H22肝癌移植瘤生長(zhǎng)的機(jī)制，為其臨床抗癌應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.建立H22肝癌皮下荷瘤模型，隨機(jī)分為荷瘤對(duì)照組、PESV組、化療(Rapamycin)組和聯(lián)合治療(PESV+

2、Rapamycin)組。測(cè)量腫瘤體積并計(jì)算抑瘤率，描繪腫瘤體積增長(zhǎng)曲線，觀察PESV對(duì)H22肝癌移植瘤生長(zhǎng)的影響。
　　2.常規(guī)HE染色，光鏡下觀察H22肝癌組織病理變化。
　　3. VIII因子標(biāo)記腫瘤微血管，檢測(cè)H22肝癌組織微血管密度（MVD），觀察PESV、化療以及PESV聯(lián)合化療對(duì)H22肝癌血管生成的影響。
　　4.免疫熒光及免疫組化法檢測(cè)各組H22肝癌組織中mTOR、HIF-1α、VEGF-A、ULK1和L

3、C3A的變化。
　　5. Western blot法檢測(cè)各組H22肝癌組織中mTOR、HIF-1α、VEGF-A、ULK1和LC3A的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.蝎毒多肽提取物對(duì)小鼠H22肝癌移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　與荷瘤對(duì)照組相比，PESV組、Rapamycin組、聯(lián)合組腫瘤生長(zhǎng)速度較荷瘤對(duì)照組受到明顯抑制（P＜0.05，P＜0.01）,腫瘤重量降低，抑瘤率分別為29.2％，17.7%和44.8%。聯(lián)合治療組和R

4、apamycin組抑瘤作用最強(qiáng)，瘤重顯著較低，與荷瘤對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與Rapamycin組比較，聯(lián)合組的瘤重和腫瘤體積亦均存在顯著差異
　?。≒＜0.05）。
　　2. HE染色觀察各組H22肝癌移植瘤組織標(biāo)本的形態(tài)
　　HE染色顯示，聯(lián)合組可見(jiàn)大面積壞死區(qū)，有較多的核碎裂、核固縮等凋亡和壞死的形態(tài)學(xué)改變；PESV組和Rapamycin組亦有明顯壞死，但壞死程度相對(duì)減輕；荷瘤對(duì)照組壞死區(qū)較少

5、，且壞死面積較小，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好，少見(jiàn)壞死及凋亡等形態(tài)學(xué)變化。
　　3.各組腫瘤組織MVD的表達(dá)變化
　　免疫組織化學(xué)染色顯示，VIII因子標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞胞漿染色陽(yáng)性，呈棕黃色，微血管散在分布。與荷瘤對(duì)照組相比，Rapamycin組、PESV組、聯(lián)合治療組MVD表達(dá)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)；與 Rapamycin組相比，聯(lián)合組明顯降低(P<0.05)。
　　4.免疫熒光及免疫組

6、織化學(xué)染色檢測(cè)各組腫瘤組織 mTOR、HIF-1α、VEGF-A、ULK1和LC3A蛋白表達(dá)
　　冰凍切片熒光顯微鏡觀察顯示，mTOR、HIF-1α和VEGF-A的對(duì)照組中可見(jiàn)明顯的綠色熒光，干預(yù)組的熒光相比之下有不同程度的降低；ULK1和LC3A的聯(lián)合用藥組中有明顯的綠色熒光，而其它組較低。
　　免疫組織化學(xué)染色顯示，mTOR、VEGF-A、ULK1和LC3A主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞漿，以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，HIF-1α

7、表達(dá)于細(xì)胞核和胞漿中，以出現(xiàn)棕黃色或褐色為陽(yáng)性。經(jīng)半定量圖像灰度值分析，三個(gè)干預(yù)組mTOR、HIF-1α、VEGF-A蛋白表達(dá)平均灰度值高于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)，蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)；ULK1、LC3A蛋白平均灰度值高于對(duì)照組，蛋白表達(dá)量均高于荷瘤對(duì)照組（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組與 Rapamycin組比較，mTOR、HIF-1α、VEGF-A蛋白表達(dá)減少，ULK1、LC3A蛋白表達(dá)增多（

8、P＜0.05）。
　　5. Western blot檢測(cè)各組腫瘤組織mTOR、HIF-1α、VEGF-A、ULK1和LC3A蛋白表達(dá)
　　Western blot半定量檢測(cè)結(jié)果顯示，與荷瘤對(duì)照組相比，三個(gè)干預(yù)組mTOR、HIF-1α、VEGF-A蛋白表達(dá)條帶均減弱（P＜0.05），ULK1、LC3A蛋白表達(dá)條帶增強(qiáng)（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組與 Rapamycin組比較，mTOR、HIF-1α、VEGF-A蛋白表達(dá)減少，UL

9、K1、LC3A蛋白表達(dá)增多（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. PESV及PESV聯(lián)合Rapamycin能夠抑制H22肝癌移植瘤生長(zhǎng)，聯(lián)合作用優(yōu)于單獨(dú)用藥。
　　2. PESV及PESV聯(lián)合Rapamycin能夠抑制H22肝癌移植瘤的血管生成，這可能與抑制mTOR、HIF-1α、VEGF-A蛋白的表達(dá)有關(guān)；聯(lián)合作用優(yōu)于單獨(dú)用藥。
　　3.PESV及PESV聯(lián)合Rapamycin能夠增強(qiáng)H22肝癌細(xì)胞的自噬，促