人參皂甙Rb1調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　動脈粥樣硬化(AS)是一種發(fā)生在動脈管壁的慢性炎癥性疾病。炎癥反應(yīng)增加了斑塊的面積及其復(fù)雜性。平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞參與斑塊的炎癥反應(yīng)，其中巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞是一種可塑性很強(qiáng)的細(xì)胞，在不同的微環(huán)境的刺激下，巨噬細(xì)胞可以分成兩種表型：干擾素-α(IFN-α)或者脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的細(xì)胞命名為M1；IL-13或者 IL-4誘導(dǎo)的細(xì)胞命名為M2。這兩種巨噬細(xì)胞分別通過分泌促炎和

2、抗炎細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮不同作用。M1是有效的防御細(xì)胞，能夠殺死微生物，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，比如TNF-α、IL-6和IL-1β。相反，M2產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子，緩解炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了血管再生和組織修復(fù)，如IL-10, TGF-β。最近的研究證明M2巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化中可能發(fā)揮保護(hù)作用。在ApoE-/-小鼠早期斑塊中有更多M2巨噬細(xì)胞，然而在晚期斑塊中有更多M1巨噬細(xì)胞。最近的研究已經(jīng)證明巨噬細(xì)胞表型決定斑塊的結(jié)局。人參皂甙Rb1是人參

3、的活性成分，人參是一種在東亞地區(qū)被廣泛應(yīng)用的草本植物。許多研究已經(jīng)證實了它強(qiáng)大的藥理學(xué)作用，包括抗癌、抗炎、降脂、抗肥胖及抗缺血再灌注損傷和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Rb1也已經(jīng)被證實有強(qiáng)大的抗炎效應(yīng)及降低高脂喂養(yǎng)肥胖小鼠的促炎細(xì)胞因子水平?？紤]到巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的作用，我們假設(shè)Rb1可能通過影響巨噬細(xì)胞極化增加動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性及降低炎癥反應(yīng)。
　　目的：
　　1.觀察Rb1對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的作用。
　　2.探

4、討Rb1是否通過影響巨噬細(xì)胞極化進(jìn)而改善動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及其可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.分離腹腔巨噬細(xì)胞
　　C57BL/6小鼠(8-10周齡)腹腔注射1 mL3%巰基乙酸肉湯。3天后，用冷的PBS沖洗小鼠腹腔收集巨噬細(xì)胞。800 rpm離心5分鐘后，去掉PBS，用1640 RPMI培養(yǎng)基（含10% FBS和1%雙抗）重懸細(xì)胞。種板，3 h后用 PBS沖洗去除非貼壁細(xì)胞。
　　2.細(xì)胞培養(yǎng)
　　R

5、AW264.7細(xì)胞系用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放于37°C含有5%CO2的孵箱中。RAW264.7細(xì)胞系被分為六組：control,LPS,LPS+Rb1(10μM,20μM,40μM,80μM)。
　　3.蛋白質(zhì)印跡法
　　檢測iNOS,Arg1,p-stat6和stat6蛋白表達(dá)水平。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)
　　RAW264.7被清洗、封閉，用APC結(jié)合的抗鼠的CD206抗體孵育。流式細(xì)胞儀(B

6、D Biosciences)收集細(xì)胞，結(jié)果用FlowJo(Tree Star,Inc.)分析。
　　5.細(xì)胞因子的檢測
　　細(xì)胞上清的MMP-9、IL-10、IL-4和IL-13水平用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定。
　　6.主動脈染色
　　用油紅O染色觀察脂質(zhì)含量，用天狼猩紅染色觀察膠原含量，用MOMA-2抗體染斑塊巨噬細(xì)胞，用α-SMA抗體染斑塊平滑肌。為評估斑塊平滑肌穩(wěn)定性，我們用斑塊穩(wěn)定性指數(shù)：(膠原含

7、量+平滑肌含量)/(油紅O染色面積+巨噬細(xì)胞含量)。
　　結(jié)果
　　1.與LPS組相比，Rb1劑量依賴性的抑制iNOS(M1標(biāo)記物)的表達(dá)，同時20和40μM Rb1增加Arg-1(M2標(biāo)記物)的表達(dá)。另外，通過流式細(xì)胞學(xué)分析Rb1組CD206+細(xì)胞數(shù)目百分比明顯高于LPS組。Rb1抑制促炎細(xì)胞因子MMP-9的分泌，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌。
　　2.Rb1處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞上清的IL-4和IL-13水平

8、明顯升高。IL-4和IL-13的中和抗體能夠部分減弱Rb1對M2的極化效應(yīng)。
　　3.用20μM Rb1處理細(xì)胞后，p-STAT6較LPS組有明顯增加。STAT6的抑制劑(leflunomide)能夠明顯抑制Rb1誘導(dǎo)的M2極化效應(yīng)。
　　4.Rb1處理小鼠7周后，斑塊脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞的含量明顯降低，膠原和平滑肌的含量明顯增加。同時計算Rb1組斑塊穩(wěn)定性增加，斑塊內(nèi)MMP-9表達(dá)減少。
　　5.Rb1組斑塊MOMA-2+