人腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)SIGIRR對NF-κB活化的調(diào)控和NF-κB對SIGIRR的反饋調(diào)控以及SIGIRR調(diào)控EMT發(fā)生機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景和目的：狼瘡腎炎（LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)最常見的并發(fā)癥之一，且LN的嚴(yán)重程度對SLE患者死亡率及預(yù)期壽命有顯著影響。目前為止LN的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確闡明。目前越來越多的研究報道 Toll樣受體/白細(xì)胞介素-1受體(TLR/IL-1R)信號通路參與SLE的發(fā)病機(jī)制。單一免疫球蛋白白細(xì)胞介素1受體相關(guān)蛋白(SIGIRR)，又稱為Toll/interleukin-1受體8(TIR8)，是TLR/IL-1R家族的成員，越來越多

2、的證據(jù)表明SIGIRR對TLR/IL-1R信號通路具有負(fù)調(diào)控作用，并有可能成為SLE治療的潛在靶點，但是何種機(jī)制調(diào)控SIGIRR的表達(dá)，目前還不清楚。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（NF-κB）是一類功能廣泛的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，被激活后可以調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在LN等免疫介導(dǎo)的腎臟疾病中TLR/IL-1R-NF-κB過度活化，參與調(diào)控炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子的產(chǎn)生。臨床上很多藥物的作用機(jī)制也是干預(yù)NF-κB的活化而控制疾病的發(fā)展。因此我們將在人腎小

3、管上皮細(xì)胞內(nèi)探討SIGIRR可以調(diào)控NF-κB(p65)的過度活化和活化的NF-κB(p65)是否反過來又可以調(diào)控 SIGIRR的表達(dá)，控制自我的過度活化使免疫保持平衡。另外在LN等慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末腎功能衰竭的進(jìn)程中腎間質(zhì)纖維化（RIF)發(fā)揮著重要作用，其中腎小管上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)，也稱為腎小管上皮細(xì)胞肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是RIF發(fā)生的關(guān)鍵事件。研究發(fā)現(xiàn) LN患者腎臟組織中過度表達(dá)活化的白介素lβ(IL-1β)可以通過

4、TLR/IL-1R信號通路誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，在 RIF的形成中發(fā)揮重要作用，而 SIGIRR對該信號通路具有負(fù)調(diào)控作用，因此我們將探討是否SIGIRR可以經(jīng)TLR/IL-1R-NF-κB信號通路阻斷IL-1β誘導(dǎo)的信號活化而改善人腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化的發(fā)生。
　　方法：第一部分：針對SIGIRR基因的有效靶點設(shè)計 shRNA序列，與GV248-GFP-Puro慢病毒載體連接產(chǎn)生重組體(GV248-GFP-Pu

5、ro-shSIGIRR)。將測序驗證正確的重組體與包裝質(zhì)粒(pMDL、pRev和pVSVG)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，收集病毒并感染HKC細(xì)胞。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和western blot法分析檢測HKC細(xì)胞中SIGIRR干涉效率。應(yīng)用IL-1β刺激成功敲低SIGIRR的HKC細(xì)胞及對照細(xì)胞，western blot檢測其下游核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(p65)的磷酸化水平，熒光定量PCR分析單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MC

6、P-1)和正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的活化調(diào)節(jié)蛋白(RANTES）mRNA水平。第二部分：該部分研究以野生型HKC為模型，構(gòu)建p65穩(wěn)定下調(diào)的HKC細(xì)胞系（HKC/shp65），經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、western blot和免疫熒光法檢測SIGIRR表達(dá)情況。在線預(yù)測SIGIRR啟動子區(qū)域NF-κB(p65)的結(jié)合位點，以野生型HKC細(xì)胞為模版，染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP）初步驗證NF-κB(p65)可以結(jié)合至SIGIRR啟動子

7、區(qū)域。提取人全基因組DNA，PCR方法調(diào)取SIGIRR啟動子序列連接至pGL3-Basic熒光素酶報告基因載體上。酶切和測序驗證成功構(gòu)建，之后把NF-κB(p65)與SIGIRR啟動子DNA結(jié)合的序列進(jìn)行定點突變構(gòu)建突變載體并測序驗證，再經(jīng)熒光素酶報告基因?qū)嶒為g接的進(jìn)一步驗證NF-κB(p65)可結(jié)合調(diào)控SIGIRR的表達(dá)。第三部分：將人SIGIRR cDNA片段連接至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX2-G418，經(jīng)PT67細(xì)胞包裝成病毒感染H

8、KC細(xì)胞，qRT-PCR和western blot證實SIGIRR過表達(dá)HKC細(xì)胞（HKC/SIGIRR）成功構(gòu)建。HKC/SIGIRR細(xì)胞及對照細(xì)胞經(jīng) IL-1β誘導(dǎo)后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，western blot和免疫熒光檢測EMT相關(guān)的分子標(biāo)記（E-cadherin和Vimentin）變化，劃痕實驗和Transwell assay檢測細(xì)胞遷移能力。提取核蛋白后 western blot檢測NF-κB（p-p65）表達(dá)，qRT

9、-PCR法檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β) mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：第一部分：成功構(gòu)建重組慢病毒載體GV248-GFP-Puro-shSIGIRR。qRT-PCR和western blot均證實在HKC細(xì)胞中成功敲低SIGIRR的表達(dá)。此外，IL-1β刺激后，與對照細(xì)胞相比，敲低SIGIRR的HKC細(xì)胞(HKC/shSIGIRR)的p65磷酸化水平上調(diào)，MCP-1和RA

10、NTES mRNA表達(dá)水平升高。第二部分：成功構(gòu)建p65穩(wěn)定干涉的HKC細(xì)胞（HKC/shp65），并發(fā)現(xiàn)干涉p65基因后，SIGIRR蛋白表達(dá)量下調(diào)。在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)在SIGIRR啟動子上游存在p65的結(jié)合位點。CHIP方法證實p65可以結(jié)合在SIGIRR啟動子區(qū)。成功構(gòu)建pGL3-SIGIRR-Luc和突變載體，經(jīng)熒光素酶實驗再次證明p65可以結(jié)合至SIGIRR啟動子區(qū)并可以調(diào)控表達(dá)。第三部分：成功構(gòu)建pLNCX2-G418-SIGIR

11、R過表達(dá)載體，qRT-PCR和western blot均證實在HKC細(xì)胞中SIGIRR成功過表達(dá)。此外發(fā)現(xiàn)與SIGIRR過表達(dá)組相比較，經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)后對照組細(xì)胞呈梭形改變，上皮細(xì)胞標(biāo)記分子上皮型鈣黏蛋白E-cadherin表達(dá)減弱，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記分子波形纖維蛋白Vimentin表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞的遷移能力亦增強(qiáng)。發(fā)現(xiàn)該作用是通過SIGIRR影響IL-1β誘導(dǎo)的TLR/IL-1R-NF-κB信號通路的激活減少TGF-β的產(chǎn)生實現(xiàn)的。